一株黑木耳绿霉病病原真菌的分离鉴定及其杀菌剂的筛选*

杨 武，罗深喜，夏志兰，徐志伟，罗 坤，**

（1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省汉寿县洲口镇农业站，湖南 汉寿 415918；3.湖南农业大学食用菌研究所，湖南 长沙 410128；4.湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙410128）

黑木耳（Auricularia auricula） 含有蛋白质、多酚、多糖等多种营养成分，是1种营养丰富的药食同源食用菌[1-2]。中国是世界上黑木耳栽培的起源地，距今已有1 400多年的栽培历史，目前总产量已达世界的90%以上[3]。近年来，黑木耳生产规模越来越大，各地黑木耳菌包厂如雨后春笋般出现，并朝着专业化分工、大型机械化生产、自动化及智能化控制方向发展[4]。但是，由于单片木耳栽培技术还不成熟，栽培生产过程中经常出现各种问题，其中细菌性病害和以链孢霉、绿霉等为主的真菌性病害，严重影响黑木耳的产量和品质[5-7]。在国外也有类似的问题，早在1985年，绿色霉菌在北爱尔兰开始流行，并迅速蔓延横跨欧洲的农场；此外，在美国和加拿大的蘑菇栽培中也有类似病状的出现，严重影响食用菌的生产[8-9]。

木霉属真菌可以产生纤维素酶、果胶酶等酶类，可用于纺织业的纤维处理、去污剂生产以及动物饲料加工等，同时对多种病原真菌有拮抗作用，已成为国内外的研究热点[10]。然而，部分木霉可产生胞外酶、有毒物质、次生代谢产物，引起黑木耳等食用菌的绿霉病，影响食用菌的生长；该病害在食用菌生产过程中普遍发生，给食用菌的栽培带来灾难[11-12]。王晶[13]通过对北京、河北、山东、辽宁、黑龙江五省的食用菌发病情况的调查，发现在食用菌栽培过程中，侵染性病害主要以细菌性褐斑病为主，竞争性病害主要以木霉病为主。崔丽红[14]在贵州和辽宁两省6个地区采集了黑木耳（Auricularia auricula）、海鲜菇（Auricularia auricular）、灰树花（Grifola frondosa）、香菇 （Lentinula edodes）、和金针菇（Flammulina velutipes） 等7种食用菌的感病栽培菌棒样本61份，经分离纯化发现，木霉属真菌是感染食用菌的优势病原菌，其次为青霉属（Penicliilum）真菌、曲霉属 （Aspergillus） 真菌、镰孢菌属（Fusarium） 真菌，共占分离出的病原菌菌株的71.36%。

虽然黑木耳主要产自东北三省、河南、河北、山东等北方地区，但湖南多地的气候也适合栽培黑木耳。然而，在“北耳南移”过程中，由于湖南大部处于丘陵地带，气候潮湿，黑木耳的栽培过程中容易产生病害，这一问题成为该产业在南方发展的绊脚石。以怀化地区为例，笔者前期研究发现黑木耳生产过程中出现过青霉（Penicillium paneum）、木霉 （Trichoderma longibrachiatum） 及毛霉 （Exserohilum turcicum） 等病害，其中木霉危害最为严重，有的地块污染率达到50%以上，严重威胁到黑木耳的正常生产。针对这一问题，笔者从怀化地区采集黑木耳罹病样品，通过对病原菌进行分离鉴定，对其杀菌剂进行筛选，旨在为防治当地黑木耳的绿霉病提供一定指导。

1 材料与方法

1.1 材料

罹病黑木耳样品收集自湖南省麻阳县；供试食用菌（杏鲍菇、灵芝、大球盖菇、双孢蘑菇、姬松茸、秀珍菇）菌种均由湖南农业大学食用菌研究所提供；供试真菌的培养使用马铃薯琼脂葡萄糖（PDA）培养基；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术有限公司进行；供试杀菌剂详见表1。

表1 杀菌剂种类Tab.1 Types of fungicide

1.2 病原真菌的分离与纯化

1.3 病原真菌的鉴定

1.3.1 病原菌培养性状的观察

将保存于冰箱的病原菌菌株进行活化，待菌落长满培养皿后，用打孔器打取组织块于新的PDA培养基中央，置于28℃培养箱中培养，每隔12 h观察菌落形态，记录菌丝的厚薄、疏密和颜色变化，并测量菌落直径，

1.3.2 病原菌形态学鉴定

挑取活化的病原菌于PDA培养基上培养，待菌落变绿时进行临时片的制作，在显微镜下观察并记录分生孢子梗和分生孢子的颜色、大小等特征。木霉的鉴定参照崔丽红[14]和吴小平[15]等资料进行。

1.3.3 病原菌分子生物学鉴定

菌株AD092基因组DNA的提取：病原真菌基因组DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提盒进行。

ITS序列的PCR扩增、片段回收和序列测定：选用正向引物 ITS 1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 反 向 引 物 ITS 4： 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；以基因组DNA为模板。扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸 1 min，30个循环；72℃延伸 10 min。反应体系为25 uL。采用1%琼脂糖电泳对扩增产物进行检测，采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行PCR扩增产物的回收。待产物回收后，送至上海生工进行序列的测定。

本文从不同角度对广西与东盟国家跨境贸易发展及跨境人民币结算现状进行深入分析。同时，选取当年累计出口额、当年累计进口额及跨境人民币结算量等具有代表性的指标，运用协整检验、构建VAR模型和脉冲响应函数等分析方法，对广西跨境人民币结算ln（crmb）与广西—东盟进出口贸易ln（ix）、ln（ex）三个指标变量的关系进行实证分析。

序列分析及系统发育分析：将测序获得菌株的ITS序列与NCBI中GenBank数据库中核酸序列进行比对，通过 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析其与已知序列的相似度，推测菌株AD092的属种，结合MEGA 7软件进行系统发育分析，构建菌株的系统进化树。

1.4 病原真菌致病性回接

将病原真菌接种于PDA培养基上于28℃培养5 d，用无菌水将孢子洗脱后用3层纱布过滤，制成病原真菌孢子悬浮液备用。

取健康的黑木耳菌袋，无菌条件下将病原真菌孢子悬浮液喷洒于菌袋顶部，用等量无菌水作为对照，各设置3个重复，置于25℃、RH为60%的条件下培养，每天观察发病情况并做好记录，菌袋发病后，再次分离培养病原菌，与原接种病原菌菌株进行比较，确定致病病原菌。

1.5 长枝木霉对不同食用菌的侵染能力

鉴于食用菌菌丝比病原真菌菌丝生长慢，因此先用无菌的7 mm打孔器将活化好的6种食用菌菌丝打出大小一致的组织块，在平板一侧接种。待灵芝生长2 d，杏鲍菇生长4 d，双胞蘑菇、木耳及秀珍菇生长5 d，姬松茸生长6 d后，分别在平板另一侧接种病原菌。观察菌丝交接处食用菌菌丝的生长情况，判断长枝木霉对不同食用菌的侵染能力[15]，每个处理设3个重复。

1.6 几种杀菌剂的抑菌活性

采用菌丝生长速率法[16]进行抑菌效果的测定。选取表1中的4种杀菌剂，将100 mg·L-1的母液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的浓度进行稀释后倒入约12 mL PDA培养基（55℃左右），每皿加入1 mL上述药液混匀，制成平板。冷却后，每皿中央接种长枝木霉菌饼（直径7 mm），以水作为对照（CK），每个处理设3个重复，置于培养箱中28℃培养，待CK菌落长满整个平板的2/3时，用十字交叉法测定菌落直径，抑菌率（P，%）计算公式为：

式中：R1（mm） 表示对照菌落直径；R2表示处理菌落直径（mm）；R表示菌饼直径（mm）。

2 结果与分析

2.1 病原真菌的分离与纯化

从采集地收集的污染菌袋中，分离得到1个菌株，活化2次～4次后，置于PDA斜面培养基中培养2 d，后转至4℃冰箱保存。

2.2 病原真菌的分类鉴定

2.2.1 菌株AD092的形态特征和培养性状

菌株AD092的生长速度见图1、形态特征见图2。

图1 菌株AD092菌落生长速度Fig.1 Growth rate of colony of strain AD092

图2 长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of Trichoderma longibrachiatum

结合图1和图2分析，菌株AD092在PDA平板上生长0.5 d时菌落直径达1.97 cm，0.5 d～2.5 d为快速生长期，培养2.5 d菌落直径达到最大，为8.5 cm，4 d时菌落已全部老熟，由白色转变为绿色，且常出现“脓泡”状结构，即分生孢子梗丛束，菌丝似毡状。分生孢子梗长且较直，次级分枝通常较短，呈直角状伸出，但基部的次级分枝较长，常单个生出或互生，几乎不会再次分枝。瓶梗单生或2个～6个轮生，基部略微变细，呈圆柱状，顶部明显变细，顶端瓶梗基部不溢缩，其下着生很多间生瓶梗。分生孢子单孢无色，呈倒卵形或椭圆形，大小为 （2.3～3.1） μm × （3.9～5.5） μm。

2.2.2 菌株AD092的分子生物学鉴定

菌株AD092的分子生物学分析结果见图3、图4。

图3 菌株AD092的琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain AD092

由图3可知，菌株AD092的ITS序列全长为572 bp，通过BLAST比对发现，AD092与长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 的相似度最高，相似性为99%。

图4 菌株AD092的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain AD092

由图4可知，将菌株的ITS序列与BLAST搜索到的相近菌株进行比较，结合Mega 7软件构建系统发育树，结果表明，菌株AD092与长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）位于同一分枝上，相似度最高，结合形态特征与培养性状分析，将其鉴定为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

2.3 菌株AD092的致病性回接

菌株AD092的致病性回接试验结果见图5。

由图5可知，将分离纯化的AD092菌株回接到黑木耳菌袋上，观察发现黑木耳菌袋顶部覆盖一层深绿色霉，这一症状与采集回来的菌袋症状一致。将该菌袋中的病原菌进一步分离纯化，发现该菌的菌落形态与菌株AD092的一致，初步判断长枝木霉是黑木耳绿霉病的致病菌。

图5 菌株AD092的致病性回接Fig.5 Pathogenicity inoculation of strain AD092

2.4 长枝木霉对不同食用菌的侵染能力

平板对峙试验表明，长枝木霉对不同食用菌侵染能力不同。对灵芝、姬松茸和大球盖菇侵染能力强，木霉菌丝逐渐蔓延至交接处，并且能够侵入其菌丝，导致其菌丝的枯萎死亡。对黑木耳、杏鲍菇和秀珍菇侵染能力中等，木霉菌丝能够蔓延至交接处但不继续侵入，交接处食用菌菌丝变黄枯萎。

2.5 几种杀菌剂的抑菌活性

目前为止，在食用菌生产过程中运用的化学药剂种类较少，本文选取了4种常见的杀菌剂进行抑菌试验，结果见表2。

表2 4种杀菌剂对长枝木霉的抑菌活性测定Tab.2 Determination of inhibitory activity of 4 fungicides against Trichoderma longibrachiatum

由表2可知，在4种杀菌剂中咯菌腈对长枝木霉的抑菌效果最好，10-1稀释液抑菌率高达97.8%，稀释浓度为10-2和10-3时，抑菌率分别达到了96.7%、95.6%；其次是多菌灵，10-1稀释液抑菌率为68.9%，但稀释浓度为10-2、10-3、10-4、10-5时抑菌效果较差；其他药剂基本上没有抑菌功能。

3 结论与讨论

从怀化市麻阳县采集的30个染病的黑木耳菌袋中，分离出1种病原真菌，通过进行形态学、培养特性观察和ITS序列分析，鉴定为长枝木霉。以长枝木霉为指示菌对7种食用菌进行平板对峙，结果表明，长枝木霉对不同食用菌侵染能力不同，大部分食用菌在受到木霉感染后，生长缓慢甚至停滞，严重影响产量和品质。选用食用菌生产中常用的杀菌剂进行抑菌活性试验，发现咯菌腈对木霉的抑制效果最好，稀释液稀释浓度为10-1时抑菌率达97.8%，其次为多菌灵，稀释浓度为10-1时抑菌率达68.9%。

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、康氏木霉 （Trichoderma koningii）是污染食用菌的常见木霉种，不同地区致病率稍有差异[13]。吴小平[15]从福建省、浙江省等地分离得到4种木霉属真菌，其中哈茨木霉和长枝木霉致病率最高，共达88%。颜一红[17]从福州、古田等地分离得到7种木霉属真菌，其中长枝木霉致病率为19.78%，仅次于康氏木霉。

由于食用菌与许多病原菌及杂菌有同源性，且病原菌及杂菌一般具有繁殖快、竞争力强的特点，伴随着食用菌生产的每个环节，因此目前还没有真正有选择性的杀菌剂可供使用[18-19]。刘仁奎[15]通过苯醚甲环唑、多菌灵、百菌清、嘧菌酯、溴菌腈、异菌脲及纳他毒素对哈茨木霉的防效比较得出，纳他霉素对哈茨木霉具有较好的防效，而且纳他霉素作为一种安全的食品添加剂，具有低剂量、高防效及抗菌时间长的优点，适宜做为食用菌生产中哈茨木霉病害防治的药剂。李晶等[20]研究了7种常见的杀菌剂对菌草食用菌4种病原真菌的室内毒力测定，结果表明百菌清对哈茨木霉的抑制作用最好，而多菌灵对侧耳木霉的抑制作用最好，说明不同病原菌对杀菌剂的敏感性不同，在进行多病害防治时应选择杀菌广谱、毒性低、效果显著的农药。

木霉具有适应性强，传播蔓延快的特点[21]一旦发生，后果严重。本试验发现，咯菌腈对长枝木霉的防治效果较好，稀释浓度为10-1～10-3的稀释液对菌丝生长的抑制率均达到90%以上，可在源头上抑制木霉的传播与蔓延，将病害限制在极小范围内。同时，量少且防效显著，减少产量损失。

目前，咯菌腈在菌袋上的防效试验正在开展。而对咯菌腈有效成分的提取、结构鉴定、抑菌机理以及与其他杀菌剂的混用效果有待进一步研究，从而为黑木耳绿霉病的有效防治奠定基础。