RP-HPLC法同时测定3种不同大黄炮制品中没食子酸、桂皮酸和儿茶素的含量

魏江存 谢臻 杨正腾 马家宝 秦祖杰 王成龙 黄冬美 朱文润 陈圣斌 韩倩

中圖分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）22-3053-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.06

摘 要 目的：建立同时测定3种不同大黄炮制品中没食子酸、桂皮酸、儿茶素含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Thermo ScientificTM Hypersil GOLD Dim，流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱），检测波长为278 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。结果：没食子酸、桂皮酸、儿茶素的检测进样量线性范围分别为0.126 2～1.262 0 μg（r=0.999 9）、0.036 2～0.362 0 μg（r=0.999 9）、0.177 9～1.779 4 μg（r=0.999 8）;定量限分别为25.4、28.2、62.5 ng，检测限分别为6.2、3.6、11.8 ng;精密度、稳定性、重复性、耐用性试验的RSD均小于3%;加样回收率分别为94.64%～102.71%（RSD=2.74%，n=9）、95.35%～102.49%（RSD=2.44%，n=9）、93.65%～103.66%（RSD=3.27%，n=9）。含量测定结果显示，熟大黄中没食子酸、桂皮酸含量较高，两种成分含量大小顺序均依次为熟大黄>水蒸熟大黄>生大黄;生大黄中儿茶素含量较高，该成分含量大小顺序依次为生大黄>水蒸熟大黄>熟大黄。结论：本方法灵敏、可靠、重复性好，可用于同时测定3种不同大黄炮制品中没食子酸、桂皮酸和儿茶素的含量。

关键词 大黄;炮制品;没食子酸;桂皮酸;儿茶素;反相高效液相色谱法;含量测定

Simultaneous Determination of Gallic Acid， Cinnamic Acid and Catechin in 3 Processed Products of Rheum officinale by RP-HPLC

WEI Jiangcun1，2，XIE Zhen2，YANG Zhengteng3，MA Jiabao3，QIN Zujie1，WANG Chenglong1，HUANG Dongmei1，ZHU Wenrun4，CHEN Shengbin3，HAN Qian2（1. Zhuangyao Pharmaceutical Research and Development Center， Guangxi International Zhuang Medical Hospital， Nanning 530201， China; 2. School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China; 3. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM， Nanning 530023， China; 4. School of Pharmacy， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of gallic acid， cinnamic acid and catechin in 3 processed products of Rheum officinale. METHODS： RP-HPLC method was established. The determination was performed on Thermo ScientificTM Hypersil GOLD Dim column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 278 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of gallic acid， cinnamic acid and catechin were 0.126 2-1.262 0 μg（r=0.999 9）， 0.036 2-0.362 0  μg（r=0.999 9） and 0.177 9-1.779 4 μg（r=0.999 8）， respectively. Quantitative limits were 25.4， 28.2， 62.5 ng， and detection limits were 6.2， 3.6， 11.8 ng， respectively. RSDs of precision， stability， repeatability and durability tests were all less than 3%. The recoveries ranged from 94.64%-102.71%（RSD=2.74%， n=9）， 95.35%-102.49%（RSD=2.44%， n=9）， 93.56%-103.66%（RSD=3.27%， n=9）. The determination results showed that the contents of gallic acid and cinnamic acid in prepared R. officinale were higher， and the order of both were prepared R. officinale>steamed R. officinale>raw R. officinale. The content of catechin in raw R. officinale was higher， and the order of it was raw R. officinale> steamed R. officinale>prepared R. officinale. CONCLUSIONS： The method is sensitive， reliable and reproducible. It can be used to determine the contents of gallic acid， cinnamic acid and catechins in 3 processed products of R. officinale simultaneously.

KEYWORDS   Rheum officinale; Processed products; Gallic acid; Cinnamic acid; Catechin; RP-HPLC; Content determi- nation

我国共有大黄45个品种和2个亚种，其中只有掌叶大黄（Rheum palmatum L.）、唐古特大黄（R. tanguticum Maxim. ex Balf.）或药用大黄（R. officinale Baill.）的干燥根和根茎作为药用部位被收录至2015年版《中国药典》（一部）[1-2]。大黄在《神农本草经》中被列为中品，《本草纲目》中也有相关记载[3-4]，可内服外用，具有止血、通阻、解毒之功效[5]。临床常用饮片为生大黄、熟大黄、醋大黄、酒大黄和大黄炭[6]。不同饮片的化学成分、药效性能以及临床作用可能会随炮制条件的不同而有所差异，即中药炮制前后其化学成分的含量会发生变化[7-8]。如生大黄泻下作用较强，若煎煮时间过久，其泻下成分被破坏，使泻下作用减弱;熟大黄的主要成分为鞣质，具有止泻作用，因此大黄生用能致泻，熟用则止泻止痢[9-11]。

大黄主要含有黄酮类、鞣质类、蒽醌类、蒽酮类等成分，以往大多数研究仅以大黄炮制前后蒽醌类成分为指标[12-14]。而鞣质类成分作为大黄的有效成分之一，具有降低血清尿素氮水平、抗炎、抗菌、抗肿瘤、调节免疫等药理作用[15-16]。虽然有研究发现，大黄炮制前后其鞣质类成分没食子酸和儿茶素的含量均明显变化，但该研究的观察指标较少[17]。同时，目前尚无比较不同炮制方法对大黄中鞣质类成分含量影响的研究，也未见相关标准对其含量进行规定。基于此，本研究采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定了3种不同大黄炮制品中没食子酸、桂皮酸和儿茶素等3种鞣质类成分的含量，旨在为其质量标准研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型HPLC仪，包括四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱（美国Waters公司）;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱、HWS-26型电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）;YQ-520C型超声波清洗仪（上海音波声电科技公司）;Secura225D-1CN型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 药品与试剂

没食子酸对照品（上海融禾医药科技有限公司，批号：160928，纯度：>98%）、桂皮酸对照品（批号：20161126，纯度：>98%）、儿茶素对照品（批号：20161221，纯度：>98%）均由宝鸡市晨光生物科技有限公司提供;甲醇为色谱纯，乙醇、磷酸等均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

大黄饮片（产地：四川绵省阳市平武县，批号：170307001）购自广东康美药业有限公司，经广西中医药大学药学院李斌副教授鉴定为蓼科植物药用大黄（R. offi- cinale Baill.）的干燥根茎，按2015年版《中国药典》（四部）“0213”炮制通则[18]和《全国中药饮片炮制规范》[19]进行炮制，制得生大黄、水蒸熟大黄、熟大黄等3种大黄炮制品饮片。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo ScientificTM Hypersil GOLD Dim（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）;检测波长：278 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取没食子酸对照品6.31 mg、桂皮酸對照品3.62 mg、儿茶素对照品8.897 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，得各成分单一对照品贮备液。取上述没食子酸、儿茶素对照品贮备液各1 mL，桂皮酸对照品贮备液0.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得没食子酸、桂皮酸、儿茶素质量浓度分别为63.10、18.10、88.97 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 将炮制品饮片粉碎，取粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加70%甲醇20 mL，称定质量，超声（功率：250 W，频率：30 kHz）处理20 min，放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。3种炮制品饮片均同法操作。

2.2.3 空白对照溶液 以70%甲醇为空白对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取 “2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，理论板数以没食子酸峰计均不低于3 000，所有色谱峰的分离度均大于1.5，空白对照对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、5、8、10、12、15、20μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，没食子酸、桂皮酸、儿茶素的定量限分别为25.4、28.2、62.5 ng，检测限分别为6.2、3.6、11.8 ng。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，没食子酸、桂皮酸、儿茶素峰面积的RSD分别为0.81%、2.34%、0.71%（n=6），表明仪器精密度较好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（生大黄饮片）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、桂皮酸、儿茶素峰面积的RSD分别为2.68%、0.88%、1.59%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

将生大黄饮片粉碎， 精密称取粉末0.5 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标一点法计算样品中3种成分的含量。结果，0.5 g生大黄饮片中平均含没食子酸、桂皮酸、儿茶素4.281 5、0.711 8、3.201 8 mg，RSD分别为0.92%、2.95%、1.97%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

将生大黄饮片粉碎，精密称取粉末0.25 g，共9份，分别加入一定量的混合对照品溶液，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 耐用性试验

将生大黄饮片粉碎，取粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件，分别以不同检测波长（268、273、278 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱温（25、30、35 ℃）进样测定，记录峰面积并按外标一点法计算样品中3种成分的含量（以0.5 g生大黄饮片所含待测成分质量计），结果见表4。结果表明，该方法耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取3种大黄饮片粉末，每份0.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行操作3次，记录峰面积并按外标一点法计算样品含量（以0.5 g饮片所含待测成分质量计），结果见表5。

3 讨论

在前期预试验中，笔者参考相关文献[4，11]，分别以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和无水甲醇为提取溶剂进行比较。结果发现，以70%甲醇为提取溶剂时样品中没食子酸、桂皮酸、儿茶素的含量相对较高，故选择以70%甲醇为提取溶剂。同时又参考相关文献[17]，分别对加热回流、超声、冷浸等提取方法进行比较。结果发现，加热回流提取所得样品杂质较多且在色谱中不易分离，样品中3种成分含量易受加热温度等因素影响而出现不稳定的现象;冷浸提取所得样品中3种成分含量较低;超声提取所得样品中3种成分含量较高且杂质较少，故选择超声提取。此外，笔者还比较了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.2%冰醋酸水溶液、甲醇-0.3%冰醋酸水溶液等不同流动相体系对色谱峰的影响。结果，以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相时样品中3种成分的分离度均较好，且可与杂质峰达到基线分离，故选择以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。

生大黄、水蒸熟大黄、熟大黄均为较常见的大黄炮制品，因此笔者测定了上述3种不同大黄炮制品中鞣质类成分的含量并进行了比较。含量测定结果显示，熟大黄中没食子酸、桂皮酸含量较高，上述两种成分含量大小顺序均依次为熟大黄>水蒸熟大黄>生大黄，其原因可能与大黄中的其他成分在炮制过程中受热后发生化学变化或水解而转化为没食子酸和桂皮酸有关[17];生大黄中儿茶素含量较高，该成分含量大小顺序依次为生大黄>水蒸熟大黄>熟大黄，其原因可能与儿茶素受热极不稳定或发生水解反应有关[6，20]。

综上所述，该方法灵敏、可靠、重复性好，可用于同时测定3种不同大黄炮制品中没食子酸、桂皮酸和儿茶素的含量。

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（收稿日期：2019-04-16 修回日期：2019-09-24）

（编辑：陈 宏）