采用基因芯片技术研究丹红注射液对急性心肌梗死模型大鼠基因表达谱的影响

施洋 樊官伟 候宝林 樊登峰 张伟 鲁西亮 陈晓黎 何敏

中圖分类号 R285.5;R966 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）22-3042-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.04

摘 要 目的：探讨丹红注射液（DHI）对急性心肌梗死（AMI）模型大鼠基因表达谱的影响。方法：将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和DHI组（0.76 mL/kg），每组10只。模型组和DHI组采用冠状动脉左前降支结扎法复制AMI模型。造模后，假手术组和模型组大鼠均肌内注射等容生理盐水，DHI组大鼠肌内注射相应药物，每日1次，连续14 d。末次给药后，分离大鼠梗死边缘区心肌组织，采用基因芯片技术检测基因表达谱的变化情况，以相对表达量差异倍数为指标，筛选差异表达微RNA（miRNA）。在检索其对应基因的基础上，利用DAVID生物信息学资源数据库和KEGG通路数据库分别进行基因本体（GO）和KEGG通路富集分析;借助TargetScan数据库预测差异表达miRNA对应的靶基因信使RNA（mRNA），采用Cytoscape 3.6.1软件构建miRNA- mRNA网络并进行分析，采用Agilent GeneSpring GX v11.5软件筛选上述网络中与炎症相关的靶基因和miRNA。结果：与假手术组比较，模型组差异表达miRNA共22个，其中上调5个、下调17个;与模型组比较，DHI组差异表达miRNA共26个，均为上调;与DHI治疗AMI有关的差异表达miRNA包括rno-let-7a-5p、rno-let-7d-5p、rno-let-7f-5p、rno-miR-26b-5p、rno-miR-29b-3p、cel-miR- 39-3p、cel-miR-39-5p、rno-miR-142-5p、rno-miR-191a-5p、rno-miR-409a-3p。GO和KEGG通路富集分析结果显示，差异表达miRNA对应基因主要集中在膜结合细胞器、细胞质、内膜系统等细胞组分中，通过解剖结构发育、多细胞组织发育、发育过程等生物过程来发挥蛋白结合、离子结合等分子功能;其主要富集于钙信号通路，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路，血管内皮生长因子（VEGF）信号通路，细胞凋亡，糖基磷脂酰肌醇锚定生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等信号通路上。miRNA-mRNA网络分析结果显示，与差异表达miRNA对应的靶基因mRNA共25个，与之关联的miRNA共24个;该网络中与炎症相关的靶基因共6个（IL6、IL1b、TNF、TLR4、CRP、CXCL12），涉及差异表达miRNA共19个。结论：DHI对AMI的治疗作用可能与调节相关miRNA的表达，影响钙离子、PPAR、VEGF等通路的信号转导，调控白细胞介素、趋化因子、C反应蛋白等炎症标志物的分泌有关。

关键词 基因芯片技术;丹红注射液;急性心肌梗死;差异表达;微RNA;信使RNA;信号通路;炎症;大鼠

Study on the Effects of Danhong Injection on Gene Expression Profile of Acute Myocardial Infarction Model Rats by Gene Chip Technique

SHI Yang1，2，3，FAN Guanwei3，4，HOU Baolin1，2，FAN Dengfeng1，2，ZHANG Wei1，LU Xiliang1，CHEN Xiaoli1，HE Min2（1. Dept. of Pharmacy， Karamay Municipal Peoples Hospital， Xinjiang Karamay 834000， China; 2. Dept. of Pharmacy， Karamay Hospital of TCM， Xinjiang Karamay 834000， China; 3. Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine/State Key Lab Breeding Base， Tianjin 300193， China; 4. Medical Experiment Center， the First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM， Tianjin 300193， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the effects of Danhong injection （DHI） on gene expression profile of acute myocardial infarction （AMI） model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group and DHI group （0.76 mL/kg）， with 10 rats in each group. AMI model was established by ligation of left anterior descending coronary artery in model group and DHI group. After modeling， sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intramuscularly， and DHI group was given relevant medicine intramuscularly， once a day， for consecutive 14 days. After last administration， myocardial tissue in the marginal zone of infarction was separated. The change of gene expression profile was detected by gene chip technique. Using fold-change of relative expression as index， differentially expressed microRNA （miRNA） were screened. On the basis of retrieving their corresponding genes， gene ontology （GO） and KEGG pathway enrichment analysis were carried out by using DAVID bioinformatics resource database and KEGG pathway database， respectively. TargetScan database was used to predict the target gene messenger RNA （mRNA） corresponding to differentially expressed miRNA. Cytoscape 3.6.1 software was used to construct and analyze the miRNA-mRNA network. Agilent GeneSpring GX v11.5 software was used to screen target genes and miRNA related to inflammation in the above networks. RESULTS： Compared with sham operation group， there were 22 differentially expressed miRNAs in model group， 5 up-regulated and 17 down-regulated. Compared with model group， there were 26 differentially expressed miRNAs in DHI group， and all of them were up-regulated. The differentially expressed miRNAs related to DHI therapy for AMI included rno-let-7a-5p， rno-let-7d-5p， rno-let-7f-5p， rno-miR-26b-5p， rno-miR-29b-3p， cel-miR-39-3p， cel-miR-39-5p， rno-miR-142-5p， rno-miR-191a-5p， rno-miR-409a-3p. Results of GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis showed that differentially expressed miRNAs were mainly concentrated in membrane-bound organelles， cytoplasm， endometrial system and other cell components. The molecular functions such as protein binding and ion binding were exerted through biological processes such as anatomical structure development， multicellular tissue development and development process，which were mainly enriched in calcium signaling pathway， PPAR signaling pathway， VEGF signaling pathway， cell apoptosis， glycosylphosphatidylinositol anchored biosynthesis， valine， leucine and isoleucine degradation， etc. miRNA-mRNA network analysis showed that there were 25 target gene mRNAs corresponding to differentially expressed miRNA and 24 miRNAs related to it. There were 6 inflammation-related target genes （IL6， IL1b， TNF， TLR4， CRP， CXCL12） in this network， involving 19 differentially expressed miRNAs. CONCLUSIONS： The therapeutic effect of DHI on AMI may be related to regulating the expression of related miRNA， affecting signal transduction of calcium ion， PPAR and VEGF pathways， and regulating the secretion of inflammatory markers such as interleukin， chemokine and C-reactive protein.

KEYWORDS   Gene chip technique; Danhong injection; Acute myocardial infarction; Differential expression; MicroRNA; Messenger RNA; Signaling pathway; Inflammation; Rat

急性心肌梗死（AMI）是临床上常见的急危重症，属急性冠脉综合征（ACS）的严重类型，是心血管疾病中最主要的致死因素之一[1]。该病既往常见于欧美发达国家，据一项为期26年的随访研究显示，美国35～84岁中老年人群中AMI的男性发病率为71‰，女性为22‰;每年约有150万人新发AMI，45万人发生再次心肌梗死[2]。受社会经济发展、人口老龄化加剧、饮食习惯改变、心理状态变化等因素的影响，我国AMI的发病率呈逐年上升的趋势[3]。该病发病机制主要是冠状动脉粥样硬化形成不稳定的粥样斑块溃破，继而引发出血和管腔内血栓形成，从而使管腔闭塞，且通常是由一支或多支血管发生阻塞而侧支循环尚未充分建立所造成的心肌缺血缺氧，最终导致患者心肌大面积坏死，这一过程与机体炎症反应密切相关[4]。为防止梗死范围扩大，缩小缺血面积以挽救濒死心肌是AMI治疗的重要环节;此外，消除炎症反应等各种不利因素的影响以避免心功能的持续恶化，也日益成为临床关注的焦点之一[5-6]。

丹红注射液（DHI）是在传统中医理论指导下结合现代制药技术制成的中药注射剂，由丹参和红花两味中药组成，具有活血化瘀、通脉舒络之功效，可用于临床治疗瘀血闭阻所致的胸痹、中风以及冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑血栓等症[7-8]。AMI发生后，机体内多种基因[如基质金属蛋白酶（MMP）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）等的编码基因]的表达均发生改变，其中微RNA（miRNA）的变化备受学者关注[9]。miRNA可通过调节靶信使RNA（mRNA）的翻译过程来调控基因的表达，进而影响炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等一系列生物学效应[10]。有研究指出，AMI发生后，机体内多种miRNA表达水平发生变化，并参与AMI的进展，从而影响患者的治疗结局[11-12]。目前，对于AMI发生后miRNA的作用类型及具体机制尚处于初始研究阶段，且中药干预AMI的作用机制及靶点亦未完全明确。鉴于此，本研究通过建立AMI大鼠模型，利用基因芯片技术分析DHI对其心肌梗死边缘区基因表达谱的影响;在筛选差异表达miRNA的基础上，从基因功能、信号通路等方面挖掘DHI对AMI的潜在调控机制，并初步探讨该药对炎症反应的可能影响，以期为DHI作用机制阐释及其临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

MP-150型多导生理记录仪（美国BioPac公司）;ALC-V8型小动物呼吸机（上海精密科学仪器有限公司）;STEMI2000-C型体视显微镜（德国Zeiss公司）;Microfuge22R型冷冻离心机（美国Beckman公司）;CFX96型实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）仪（美国Bio-Rad公司）;E-espect型吸光-荧光光度计（日本Malcom公司）;G2939A 2100型生物分析仪（美国Agilent公司）;NanoDrop2000型分光光度计（美国Thremo Fisher Scientific公司）。

1.2 药品与试剂

DHI（菏泽步长制药有限公司，批号：17121030，规格：每支装10 mL）;注射用青霉素钠[石家庄制药集团有限公司，批号：017140617，规格：0.96 g（160万单位）];QIAzol Lysis组织样本裂解试剂（批号：79306）、miRNA纯化试剂盒miRNeasy Mini Kit（批号：217004）、miRNA定量检测试剂盒miScript Ⅱ RT Kit（批号：218161）、设置和优化的miRNA定量检测试剂盒miScript PCR Starter Kit（批号：218193）、miRNA定量检测试剂盒miScript SYBR? Green PCR Kit（批号：218073）、miRNA表达谱分析试剂盒miScript miRNA PCR Arrays（批号：331231）均购自德国Qiagen公司;其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠30只，雄性，体质量220～250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2014-0008。所有大鼠均饲养于天津中医药大学医学动物实验中心清洁级动物房内，温度为20～25 ℃，相对湿度为40%～60%，每12 h交替明暗环境，每2 d更换1次垫料。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将30只SD大鼠按随机数字表法分为假手术組、模型组和DHI组，每组10只。模型组和DHI组大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法复制AMI模型：大鼠麻醉后，将胸前及颈部皮肤备皮并消毒，沿颈部正中切开，牵拉周围肌肉暴露气管。将静脉鞘管针带芯插入气管内，拔出针芯，连接小动物呼吸机进行辅助呼吸（呼吸频率：80次/min，潮气量：4 mL，呼吸比：1 ∶ 1）并记录心电图。于3、4肋间隙作一斜行长约1.5 cm的切口，逐层钝性分离肌肉，撑开胸腔，暴露心脏。在体视显微镜下剥离心包膜并寻找肺动脉圆锥和左心耳，于两者交界且距冠状动脉起始点下方1～2 mm处进针，深度1.0～1.5 mm，以6/0号缝合线结扎。若大鼠心电图呈S-T段弓背上抬、T波高耸、QRS波电压增高伴波幅增宽则判定造模成功[13]。术后腹腔注射青霉素钠（40万单位，每日1次，连续3 d）以预防感染。假手术组大鼠只穿线不结扎，其余操作同上。造模成功后，DHI组大鼠肌内注射DHI（0.76 mL/kg，剂量根据临床用量并结合本课题组前期研究结果[14]换算而得），假手术组和模型组大鼠均肌内注射生理盐水（0.76 mL/kg），每日1次，连续14 d。

2.2 组织取材

末次给药2 h后，以颈椎脱臼法处死大鼠。取出心脏，剪开右心耳，经腹主动脉用磷酸盐缓冲液（PBS，pH为7.2～7.4）清洗2次，每次50 mL。保留左心室游离壁部分，剪去发白梗死区，取梗死边缘区心肌组织约50 mg，用锡箔纸包裹后，放入冻存管中，于液氮中速冻30 min后，转入-80 ℃超低温冰箱保存，待检。

2.3 总RNA提取和纯化

使用QIAzol Lysis组织样本裂解试剂裂解大鼠心肌梗死边缘区组织，以异丙醇沉淀法[15]提取其总RNA;使用miRNeasy Mini Kit试剂盒按其说明书方法进行纯化。

2.4 miRNA基因芯片检测

采用分光光度计分别于260、280 nm波长处检测总RNA的吸光度（A），若其A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0则表明RNA纯度较高[16]。采用生物分析仪对总RNA进行凝胶电泳分析，通过对比电泳条带灰度值来计算总RNA的分子完整数（RIN）及28S/18S，若其RIN≥7且28S/18S≥0.7即为合格RNA[17]，可进行后续试验。应用miScript Ⅱ RT Kit对包含miRNA的总RNA进行逆转录，参照miScript PCR Starter Kit试剂盒说明书设置和优化miRNA的定量分析，采用miScript SYBR? Green PCR Kit对miRNA进行检测，采用miScript miRNA PCR Arrays对miRNA表达谱进行分析。上述试验平行操作3次，芯片数据汇总、分析由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

2.5 差异表达miRNA筛选及分析

将假手术组、模型组、DHI组进行两两匹配，即假手术组与模型组、模型组与DHI组。采用RT-PCR法以实时RT-PCR仪分析上述各组样品miRNA的表达情况，引物、反应体系及反应条件均参照miScript SYBR? Green PCR Kit试剂盒说明书，采用2-ΔΔCt法计算并定量分析其相对表达量（Ct值为每个样品的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）。同时，将所得Ct值导入MiRNA在线分析软件（http：//pcrdataanalysis.sabiosciences.com/mirna）中进行分析，将相对表达量差异倍数（Fold- change）≥1.5且P<0.05的miRNA定义为差异表达miRNA[18]。对上调、下调的miRNA进行汇总、分析，并在分组比较的基础上，筛选与DHI治疗AMI有关的差异表达miRNA。

2.6 基因本体（GO）分析

借助miRBase数据库（https：//www.mirbase.org）检索“2.5”项下所得差异表达miRNA的对应基因，并以此为对象，利用DAVID生物信息学资源数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行GO分析，获知其潜在作用靶点的功能分布及富集程度。其中，功能分布包括分子功能、生物过程和细胞组分等3个方面;富集程度以富集度（即归类聚集程度，以转录域覆盖率表示）为指标，以正负值分别表示对应上调或下调靶点，其绝对值越大表明富集度越高[19]。分析结果采用WEGO 2.0软件处理，并以富集条形图展示。

2.7 KEGG通路富集分析

以“2.6”项下所得差异表达miRNA的对应基因为对象，利用KEGG数据库（https：//www.kegg.jp）进行KEGG通路富集分析，富集程度以P值表示，其值越小表明其生物学富集途径越显著[20]。分析结果采用TBtools 0.6656软件处理，并以富集条形图展示。

2.8 miRNA-mRNA网络分析

借助TargetScan数据库（http：//www.targetscan.org/）预测差异表达miRNA（包括与AMI发生以及DHI治疗有关的全部miRNA）的靶基因mRNA，并运用Cytoscape 3.6.1软件构建miRNA-mRNA网络，对差异表达miRNA与目标基因之间的相互关系进行可视化展示;同时，应用Agilent GeneSpring GX v11.5软件筛选上述网络中与炎症相关的靶基因，以此挖掘与AMI发生后炎症反应调控有关的miRNA。上述分析由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

2.9 数据处理

利用Excel 2010对芯片数据进行归一化处理后，导入RT2 Profiler qPCR Array System在线分析软件（http：//www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php）进行分析。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以 x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有統计学意义。

3 结果

3.1 差异表达miRNA筛选分析结果

与假手术组比较，模型组差异表达miRNA共22个，其中表达上调5个、下调17个，详见表1（表中，“rno”表示大鼠，“cel”表示细胞，下同）。与模型组比较，DHI组差异表达miRNA共26条，均为表达上调，详见表2。由表1、表2可见，与DHI治疗AMI有关的差异表达miRNA包括rno-let-7a-5p、rno-let-7d-5p、rno-let-7f-5p、rno- miR-26b-5p、rno-miR-29b-3p、cel-miR-39-3p、cel-miR-39- 5p、rno-miR-142-5p、rno-miR-191a-5p、rno-miR-409a-3p。

3.2 差异表达miRNA对应基因GO分析结果

差异表达miRNA对应基因主要集中在膜结合细胞器、细胞质、内膜系统等细胞组分中，通过解剖结构发育、多细胞组织发育、发育过程等生物过程来发挥蛋白结合、离子结合等分子功能，详见图1。

综上所述，DHI对AMI的治疗作用可能是通过调节相关miRNA的表达，影响钙离子、PPAR、VEGF等通路的信号转导，调控IL、TNF、CXCL、TLR、CRP等炎症标志物的分泌等途径来实现的。但本结论尚有待更多基础研究予以进一步验证。

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（收稿日期：2019-03-01 修回日期：2019-08-01）

（编辑：张元媛）