基于网络药理学方法的黄芩现代药理活性挖掘及其作用机制分析

董红敬，姚雪，穆岩，马双双，耿岩玲，刘峰，刘伟*，张渝洁

(1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014；2. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355，3. 临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276005)

黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，主要分布于我国的河北、辽宁、山西、山东等地，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1]。现代药理学研究表明，黄芩中化学成分具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[2-3]。中药的药理作用是多种化学成分对机体综合作用的结果，然而目前关于黄芩药理作用及机制的研究多是针对其中的单一化学成分，这对其中药作用机制的阐明有一定的局限性[4]。

随着系统生物学、分子生物学以及计算机技术的发展，网络药理学和整合药理学等前沿方法被广泛地应用于中药领域的各项研究[5-7]。网络药理学方法可以通过分析化合物与靶点之间的关系间接地说明化合物与疾病的关系，从而阐明中药中多种化合物对机体的整体作用[8-9]。这种研究方法与中医的整体观、辨证论治、协同配伍等原则类似，对于中药传统功效的生物功能阐释及药效成分(群)的发现具有重要的指导意义[10]。本研究采用高效液相色谱-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪(HPLC-ESI-Q-TOF MS)对黄芩水煎液中的化学成分进行了识别，采用网络药理学方法对黄芩中相对含量较高的化合物的作用靶点进行了预测，并对相关疾病及其作用机制进行了挖掘，以期为黄芩传统功效的作用机制研究提供参考。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、布鲁克Impact II高分辨质谱仪(德国布鲁克公司)；色谱纯乙腈(天津市康科德科技有限公司)、色谱纯甲酸(天津市大茂化学试剂厂)、纯水(美国密理博Millipore Direct-Q8超纯水机制备)；黄芩饮片(河北楚风中药饮片有限公司)。

2 方法

2.1 黄芩水煎液中化合物数据库的构建

按照本课题组前期建立的黄芩标准汤剂制备方法制备样品溶液[11]，利用Q-TOF MS技术可为液相色谱峰提供精确分子量，该技术具有可对色谱峰进行定性的优势，采用HPLC-ESI-Q-TOF MS技术对黄芩标准汤剂中主要共有峰进行定性鉴别[11]。液相条件：流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)；梯度为0～20 min，15%～25%A；20～35 min，25%～30%A；35～50 min，30%～50%A；50～65 min，50%～85%A；流速为0.8 mL/min；柱温为30 ℃。质谱条件：采集模式为正离子检测模式；干燥气体积流量为8 L/min；毛细管电压为3500 V；质荷数(m/z)扫描范围为50～1000。

提取色谱峰的质谱数据，获得色谱峰对应化合物的精确分子量，得到化合物的分子式，并通过与文献进行对比，对化合物进行定性分析，获得黄芩水煎液中化学成分[12]。通过ChemSpider网站[13]查询化合物并下载化合结构式，采用ChemBioDraw Ultra(14.0)软件提取出化合物的SMILS文件，用于化合物靶点预测。

2.2 预测化合物的靶点

在网络中，与节点相连的路线条数可以用度来表示，度值越大，靶点与化合物的作用关系越密切，也可能是化合物的关键靶点[5]。采用Swiss Target Prediction数据库[14]对黄芩标准汤剂中主要化学成分进行靶点预测(人源靶点)。采用Cytoscape(3.5.1)软件绘制化合物-靶点(compound-target，C-T)网络图，并对其拓扑特性进行分析，筛选出度值≥2的靶点。

2.3 构建靶标-疾病网络

采用CTD数据库[15]对度值≥2的靶点进行分析，查找与靶点相关的疾病，从而间接获取黄芩中化学成分与疾病之间的关系。本研究选取推理得分≥100的疾病名称，推理得分越高，说明疾病与靶点之间的关系越可靠。

2.4 通路富集分析

利用DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)数据库[16]对相关靶点的通路进行富集分析，选择P<0.05的生物通路，采用Cytoscape绘制靶点-生物通路(targets-pathways, T-P)关系网络图，分析靶点与生物通路的关系。整合C-T和T-P数据，构建主要活性成分-生物通路(C-P)作用网络，并分析成分和通路的关系，可从分子水平阐明黄芩中多种成分对治疗疾病的相互作用关系。

3 结果与分析

3.1 黄芩水煎液中化学成分的识别

图1为黄芩标准汤剂的HPLC-ESI-Q-TOF MS基峰图，显示主要有8个色谱峰，通过质谱提供的化合物分子量信息，并与参考文献比较，总共鉴定了8个化合物，分别为Baicalin、Glychionide A、Oroxylin A 7-O-β-D-glucoside、Wogonoside、Baicalein、Wogonin、Scullcapflavone II、Oroxylin A[12]。化合物具体信息如表1所示。

图1 黄芩水煎液HPLC-ESI-Q-TOF MS基峰图Fig.1 Base peak chromatogram of Scutellaria baicalensis Georgi decoction analyzed by HPLC-ESI-Q-TOF MS

表1 黄芩水煎液中化合物具体信息

续表1

3.2 黄芩主要化学成分的潜在靶点反向虚拟筛选

将8个化合物结构式分别投入到Swiss Target Prediction数据库[14]，进行作用靶点的反向虚拟筛选，共匹配得到44个潜在靶点。使用Cytoscape软件绘图，得到C-T相互作用关系网络图(图2)。该网络共有52个节点，包含8个化学成分和44个靶点蛋白，组成120条化合物-靶点关系。该网络描述了化合物-靶点的相互作用关系，解释了黄芩多种化学成分潜在药理作用的相互作用关系(节点和边分别表示化合物和靶点及其之间的作用关系)。如表2所示，C-T相互作用关系网络图中，度值>5的靶点有7个，分别为PTGS1(前列腺素内过氧化物合酶1)、PTGS2(前列腺素内过氧化物合酶2)、TDP1(酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1)、ADORA1(腺苷A1受体基因)、AKR1B10(醛糖还原酶相似蛋白1)、AKR1B15(醛糖还原酶1B15)、AKR1B1(醛糖还原酶)。研究表明，PTGS1和PTGS2与动脉粥样硬化、炎症、脑卒中有密切的关系[17]；TDP1是治疗肿瘤的潜在靶点[18]；ADORA1是缺血性脑损伤修复及炎症、镇痛的靶点[19-20]；AKR1B10是肿瘤、乙肝病毒的靶点，并且具有代谢毒性醛酮物质、调节脂质合成的功能[21]。以上研究说明，中药黄芩具有治疗疾病多靶点、多种药理活性的特点。

图2 黄芩中化合物-靶点关系网络图Fig.2 The compound-target network of Scutellaria baicalensis Georgi

表2 度值大于5的靶点

3.3 黄芩主要化学成分的潜在靶点与疾病的相互关系

通过CTD在线分析平台筛选度值大于等于2靶点蛋白相关疾病，绘制T-D关系网络图(图3，度值大于等于8)，度值越大说明靶点与疾病之间的关系越密切。T-D网络中共包含38个节点，包括13个靶点，涉及25种疾病，主要有化学以及药物诱导的肝损伤(chemical and drug induced liver injury)、体重减轻(weight loss)、炎症(inflammation)、增生(hyperplasia)、坏死(necrosis)、纤维化(fibrosis)、产前暴露迟发效应(prenatal exposure delayed effects)、肾病(kidney diseases)、水肿(edema)、中毒(poisoning)、高血压(hypertension)、学习障碍(learning disorders)、记忆障碍(memory disorders)、肝肿大(hepatomegaly)、神经损伤(nerve Degeneration)、认知障碍(cognition disorders)、药物相关副作用和不良反应(drug-related side effects and adverse reactions)、微核染色体缺陷(micronuclei, chromosone-defective)、肿瘤(neoplasms)、肿瘤细胞转化(cell transformation, neoplastic)、肝脏肿瘤(liver neoplasms)、蛋白尿(proteinuria)、动物疾病 (animal disease models)、出血(hemorrhage)和心脏病(heart disease)。

以上结果表明，黄芩的8种黄酮类成分可以靶向多种疾病的相关蛋白，展现了广泛的药理活性，主要涉及到血液系统、心血管系统、肝脏、肾脏等相关疾病，这与黄芩的现代药理活性实验研究基本一致[22-28]。同时，经过网络拓扑学分析，发现黄芩黄酮类成分可以靶向出血性疾病的相关蛋白，预测黄芩可能对出血性疾病具有潜在的疗效，这与传统上认为的黄芩的止血功效有一定的相关性，但目前关于黄芩止血活性的研究报道较少。因此，采用网络药理学研究方法可为传统药物的功效提供现代医学阐释，可为黄芩新的药理作用机制及其有效成分的发现提供理论指导。

图3 黄芩中化学成分靶点-疾病关系网络图Fig. 3 The target-disease (T-D)network of chemical constituents in Scutellaria baicalensis Georgi

3.4 生物功能富集分析

利用DAVID数据库对度值≥8的T-P网络中涉及的13个靶点蛋白在信号通路中的作用进行了KEGG通路富集分析，共得到了12条信号通路，其中P<0.05有6条(图4)，包括代谢通路(Metabolic pathways)、脂肪细胞代谢通路(Regulation of lipolysis in adipocytes)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、5-羟色胺突触(Serotonergic synapse)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、钙离子信号通路(Calcium signaling pathway)。研究证实，黄芩水煎液可通过调节体内物质的代谢治疗肥胖和高甘油三酯血症[25,29];通过调节精氨酸生物合成，从而抑制NO的产生，发挥抗炎活性[24]；黄芩素可通过增加体内5-羟色胺的含量发挥神经保护的活性;通过调节钙离子信号通路防止心肌细胞的损伤[30-31]。综上所述，网络药理学方法预测的部分结果与现在已经报道的研究机制一致，证明了此方法预测的可靠性，同时也说明黄芩水煎液中化学成分可作用于多个靶点，调节体内多个生物合成和代谢信号通路，从而达到治疗多种疾病的作用。

图4 黄芩中化学成分靶点-通路关系网络图Fig. 4 The T-P network of the chemical constituents in Scutellaria baicalensis Georgi

4 讨论

本研究采用HPLC-ESI-Q-TOF MS对黄芩标准汤剂中的化学成分进行识别，发现黄芩水煎液中主要含有8个黄酮类化学成分。采用网络药理学方法对8种黄酮类成分的靶点进行筛选，发现黄芩除了与已报道的抗炎、抗肿瘤等疾病相关，还与水肿、中毒、高血压、出血、心脏病等多种疾病相关，这与黄芩传统功效的泻火解毒、止血的功效相近。进一步对靶点的信号通路进行富集分析，发现了12条相关信号通路，表明黄芩中化学成分具有多靶点、多通路的药理作用特点。该研究为黄芩整体药理作用及机制的研究奠定了基础。