模式生物斑马鱼在听觉领域的应用

刘可春，高燕，张云，何秋霞，韩利文，李宁，季秀娜，孙晨

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院生物研究所， 山东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选工程技术研究中心，山东 济南 250103)

听力残疾是指由于各种原因导致的双耳听力丧失或听觉障碍，严重影响着患者的生存质量。据世界卫生组织2014年发布的数据显示，全球约有3.6亿人患有耳聋疾病，占全球总人口的5%，其中，7岁以下患儿高达80万[1]。耳聋疾病严重影响患者的生活、工作和人际交往等,因此，利用合适的动物模型，对耳聋疾病的发生、发展进行研究，可为该类疾病的治疗及相关药物的研发提供新的理论依据，具有非常重要的意义。

斑马鱼(Daniorerio，Zebrafish)隶属于鲤科，是近年来兴起研究的一种新型脊椎动物模式生物，成鱼体长3～4 cm。近年来，包括美国国立卫生研究院在内的国内外科研院所一直致力于将斑马鱼作为模式生物应用于脊椎动物发育、生理和疾病等的研究当中[2]。在听力研究领域，斑马鱼凭借其独有的生理特征，应用日益广泛。基于此，本文对近年来斑马鱼模型在听觉领域的研究现状及其进展进行了综述。

1 斑马鱼的自身优势

1.1 斑马鱼的一般特征

斑马鱼是一种小型热带鱼类，身体呈纺锤形，全身布满多条深蓝色纵纹。雌鱼一年四季均可排卵，每次排卵可多至200余枚。斑马鱼体外受精、体外发育，由于其胚胎透明，因此整个发育过程均清晰可见。斑马鱼受精约120 h后，各个组织与脏器即已发育完全。受精约3个月后，可达到性成熟。受精约5个月后，可达到体成熟[3]。2005年斑马鱼的全基因组已完成测序，2013年英国的Sanger研究所完成了斑马鱼的参考基因组测序。研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统的全基因组分析，深入解析了斑马鱼编码基因的功能。研究发现，约71.4%的人类基因在斑马鱼中均可找到至少一个同源基因，约69%的斑马鱼基因在人类中也可找到至少一个同源基因。除此之外，在生理结构、蛋白功能、细胞内部的信号通路等方面，斑马鱼也表现出与人类极高的相似性[4]。

1.2 斑马鱼的听觉器官

斑马鱼的听觉器官主要由内耳、韦伯氏器与侧线系统组成[5-6]。成年斑马鱼的内耳包含3个耳石器官(椭圆囊、听壶、球囊)和3个相互垂直排列的半规管(前、后和水平半规管)。椭圆囊和3个半规管共同构成斑马鱼的前庭系统，该系统主要负责维持机体的平衡，且对重力加速度特别敏感，听壶与球囊则主要负责听觉的形成[7]。在斑马鱼3个耳石器官的内部，各有一块加厚的区域，称为“囊斑”，相当于哺乳动物内耳中的柯蒂氏器(Corti’sorgan)。斑马鱼的囊斑由密集的感觉毛细胞和支持细胞组成，两种细胞相互隔离，穿插排列。内耳中的感觉毛细胞是一种特化的上皮细胞，可以感受声波的机械振动[8]。当外界的声音刺激以机械振动的方式传递至内耳感觉毛细胞时，感觉毛细胞顶端的纤毛会发生弯曲，继而引发纤毛膜离子通道的开放，导致膜的去极化，神经递质随即从感觉毛细胞底部释放。此时，外界的声音刺激即由机械振动转换成了可被听觉中枢识别的电信号。

韦伯氏器是斑马鱼前方几个椎骨发生异变形成的一组具有特定功能的骨片，负责将鱼鳔与内耳中的球囊相互连接。当外界的声音刺激鱼体时，鱼鳔可以加强声波的机械振幅。随后，经由鱼鳔放大的声波通过韦伯氏器可传递至球囊中的感觉毛细胞，从而最终产生听觉[9]。通过韦伯氏器，斑马鱼可以感受到高频率、低强度的声音。

侧线系统是水生脊椎动物特有的皮肤感觉器官，能感受较低频率的震动，具有控制趋流向的定位作用，同时还能协助视觉测定远近物体的位置。斑马鱼的侧线系统包括两种机械感受器，分别是位于皮肤表面的神经丘以及位于皮肤下侧线管内的管道神经丘[10]。神经丘是斑马鱼侧线系统的基本功能单位，每个神经丘中央均包含一簇受神经支配的感觉毛细胞，其功能主要为探测低频振动和局部水流，调控逃避、学习和捕食等行为[11]。斑马鱼的侧线处感觉毛细胞在结构、功能、基因调控和对耳毒性药物的反应等方面，均与人类内耳感觉毛细胞非常相似。当斑马鱼受精约第5 d时，其侧线神经丘处的感觉毛细胞即已发育完全[12]。除此之外，由于部分神经丘毛细胞位于斑马鱼皮肤表面，因此其非常便于活体观察或干预，如图1所示。截至目前为止，斑马鱼的侧线神经丘已广泛应用于毛细胞的发育、再生和听觉障碍等研究当中。

图1 斑马鱼侧线毛细胞Fig.1 Sensory hair cells in the zebrafish lateral line system

2 斑马鱼在听力研究领域的应用

2.1 药物耳毒性评价领域的应用

耳毒性药物是指其毒副作用主要损害听觉系统，中毒症状为耳鸣、眩晕、耳聋和平衡失调等的一类药物。目前由于缺少简便而有效的耳毒性评价模型，因此临床上批准上市的药物大多数缺乏耳毒性的评价指标。

2005年，Ton等[13]首次以斑马鱼作为实验动物，评价了药物的耳毒性，并初步建立了斑马鱼药源性耳毒模型。2011年，赵壮等[14]利用斑马鱼模型，研究了3种氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、新霉素和链霉素)的耳毒性作用。结果发现，上述3种药物均可影响斑马鱼的耳囊结构和感觉毛细胞数量，同时还可影响听觉器官发育相关的4种基因(Eya1、Val、Otx2和Dlx6a)的表达。2016年，Yoo等[15]研究了纳米银离子的耳毒性作用。结果显示，纳米银离子对斑马鱼的感觉毛细胞具有明显的破坏作用。2018年，Yoo等[16]利用斑马鱼作为实验动物，研究了尼古丁对感觉毛细胞的毒害效应。结果显示，尼古丁可诱导感觉毛细胞发生凋亡，且其毒性效果与尼古丁的作用浓度呈剂量依赖性。

2.2 耳毒性保护药物筛选领域的应用

氨基苷类抗生素是一种由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素,因具有抗菌谱广、抗菌能力强、用药成本低、过敏反应少等特点，在临床上应用非常广泛。目前,最常见的氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素和阿米卡星等。但是，这类药物具有较强的耳毒性，能够杀死哺乳动物内耳中的感觉毛细胞，导致听力的永久性损伤。截止目前为止，氨基糖苷类药源性耳聋尚无理想的治疗方法或者药物，所以应用合适的动物模型筛选防治该类疾病的药物显得至关重要。

与人类内耳中的感觉毛细胞类似，斑马鱼的感觉毛细胞对氨基糖苷类抗生素的耳毒性反应也相当敏感。因此以斑马鱼作为动物模型，筛选具有抗耳毒性的药物正日益受到人们的重视。2009年Ou等[17]、2012年Vlasits等[18]分别利用斑马鱼模型，对美国食品药品监督管理局批准的部分药物进行了耳毒性保护活性筛查。结果发现，六氢芬宁、莱克多巴胺和他莫昔芬等可抑制部分氨基糖苷类抗生素的耳毒性。2014年，Song等[19]应用斑马鱼模型研究了一种新型坏死抑制剂(NecroX-5)的感觉毛细胞保护活性。结果发现，NecroX-5对新霉素诱导的感觉毛细胞凋亡和线粒体损失具有明显抑制效果。Wu等[20]应用斑马鱼模型证实，维生素C、N-乙酰半胱氨酸和罗布麻素等，均可通过降低体内ROS的含量，进而缓解新霉素对感觉毛细胞的损伤。2016年，Oh等[21]以斑马鱼作为实验动物，研究了抗氧化类物质——褪黑素的耳毒性保护作用。研究结果发现，褪黑素可减少新霉素对感觉毛细胞的损伤。Hirose等[22]利用斑马鱼模型对18种候选药物的耳毒性保护活性进行了筛查，结果发现槲皮素、儿茶素和单宁酸等3种化合物对新霉素诱导的感觉毛细胞损伤具有保护作用。Esterberg等[23]研究了氨基糖苷类抗生素耳毒性的作用机制,发现当氨基糖苷类抗生素作用于斑马鱼后，线粒体对钙离子的摄取可发生改变，进而诱导大量ROS的产生，而这可能就是氨基糖苷类抗生素诱导感觉毛细胞死亡的作用机制，2019年，吴艾欣等[24]利用斑马鱼模型研究了丹参提取物对庆大霉素导致的毛细胞损伤的保护作用。结果显示，丹参提取物对庆大霉素诱导产生的耳毒性具有一定的保护功效。其中，丹酚酸B的稳定性经过改善后，有望成为潜在的耳毒性保护药物。

2.3 毛细胞再生领域的应用

哺乳动物内耳中的感觉毛细胞是一种终末分化的细胞，因此不可再生。如何通过技术手段，实现感觉毛细胞的再生，一直是听力研究领域的难题之一。2003年，Harris等[25]首次报道，斑马鱼的感觉毛细胞在缺损后存在再生现象。因此斑马鱼模型在感觉毛细胞再生领域具有区别于哺乳动物的独特优势。通过研究斑马鱼感觉毛细胞再生的机制，有助于科研人员早日破解哺乳动物感觉毛细胞再生这一难题。

2007年，Hernandez等[26]研究发现，斑马鱼再生的侧线感觉毛细胞多来源于表达Sox2基因的前体细胞。Millimaki等[27]发现，与哺乳动物类似，斑马鱼的Atoh1基因也是维持感觉毛细胞分化和发育的必需基因，当该基因过表达时，会诱导斑马鱼生成大量感觉毛细胞。2008年，Ma等[28]证实在斑马鱼体内，受损后再生的感觉毛细胞主要是由其侧线神经丘处中央群的支持细胞分裂而来。2010年，Millimaki等[29]发现，Sox2基因可维持斑马鱼感觉毛细胞的正常生存。除此之外，在感觉毛细胞再生过程中，该基因还具有调控支持细胞直接转化为毛细胞的功能。2011年，Schuck等[30]发现，腹腔注射人工合成的生长激素，可促进斑马鱼内耳中感觉毛细胞的增殖。2012年，Mackenzie等[31]证实，支持细胞在斑马鱼感觉毛细胞的再生过程中起着重要作用。2013年，周婷婷等[32]发现，Eya1和Six1b两基因在斑马鱼神经丘处感觉毛细胞再生的过程中起着重要作用。2014年，Jiang等[33]发现Wnt /β-catenin信号通路不参与调控斑马鱼感觉毛细胞再生过程的启动，只在感觉毛细胞再生过程的后期起作用。他们的工作为感觉毛细胞再生相关的信号通路研究奠定了基础。2016年，Lee等[34]发现MYC与FGF两条信号通路对于斑马鱼感觉毛细胞的再生是必须的，其中MYC主要参与细胞增殖，FGF主要参与细胞分化。2019年，Tang等[35]应用斑马鱼模型研究发现，当斑马鱼的神经丘毛细胞被新霉素破坏时，Wnt和FGF两条信号通路可以紧密结合，共同调控祖细胞与再生细胞的增殖。

3 斑马鱼在听力研究领域的常用技术方法

3.1 活体染色技术

活体染色是指利用某些无毒或毒性小的染料，来标记动植物的组织和细胞，但是又不影响其生命活动或产生任何物理、化学变化以致引起动植物死亡的一种染色技术。斑马鱼由于体外受精、体外发育，且发育早期胚胎透明，因此特别适合活体染色。除此之外，由于斑马鱼的感觉毛细胞对某些特殊荧光染料如YO-PRO1、FM1-43和FM4-64等具有选择吸收性，因此借助这些荧光染料和成像技术，可直接对其进行实时观察。

2008年，Chiu等[36]利用YO-PRO1对斑马鱼的侧线神经丘毛细胞进行了活体标记，并在此基础上筛查了美国食品药品监督管理局批准上市的约1040种药物，结果显示其中21种药物具有耳毒性。2009年，Tanimoto等[37]借助FM1-43对斑马鱼内耳中的感觉毛细胞进行标记后发现，当听觉传递通路形成以后，伴随着内耳的发育，斑马鱼中枢神经系统的听觉输入也随之产生。Gleason等[38]利用FM4-64标记了斑马鱼侧线神经丘处的感觉毛细胞。随后的研究发现，Tmie蛋白对于斑马鱼听力的形成和平衡的维持是必须的。2013年，Thomas等[39]使用FM1-43对斑马鱼的侧线神经丘感觉毛细胞进行染色后发现，顺铂诱导的毛细胞死亡依赖于毛细胞上功能型机械感知通道的存在。

3.2 行为学技术

行为学技术多用于对实验动物的高级中枢神经功能、运动能力和精神状态等进行评估，可全面反映动物的整体状态。由于斑马鱼的听觉器官位于体表，因此很容易利用行为学技术对其听觉功能进行检测。这些行为学检测方法对斑马鱼听觉系统的功能评估来说，既经济又可靠，相应的技术简单且有效[40]。

2005年，Zeddies等[41]研究发现，听觉诱发惊恐反射可作为斑马鱼前庭功能评价的有效指标。2012年，Suli等[42]报道，趋流性实验可用于评价斑马鱼侧线神经丘内感觉毛细胞的功能。Cervi等[43]对斑马鱼听觉敏感的声频范围进行研究后发现，斑马鱼的听觉敏感与训练中使用的声音刺激的频率高低密切相关。2015年，Niihori等[44]通过评估斑马鱼模型的游泳行为，对顺铂造成的感觉毛细胞损失进行研究，首次证明游泳行为的恢复可以作为毛细胞功能修复的生物学标志。2017年，Yang等[45]揭示了惊吓反应、前庭-眼反射和流变趋向性等应用于斑马鱼行为评估中的可行性，及其在听觉领域的应用潜力。2018年，Liu等[46]发现，噪声刺激可显著干扰正常斑马鱼的行为活动，但是当斑马鱼的感觉毛细胞被庆大霉素破坏后，其对噪音的敏感度会明显降低，行为活动也会发生显著改变。因此该研究表明，由噪声引起的斑马鱼行为学的变化，可作为一种评估听力的有效方法。

3.3 基因编辑技术

基因编辑技术是近年来兴起的一种能够对目标基因进行定向“编辑”的技术。通过该技术，可实现对靶标基因的功能研究。截止目前为止，科研人员已在斑马鱼模型中发现了约50种听觉相关基因，这些基因中的许多种同样影响着人类和脊椎动物的内耳[47]。因此利用基因编辑技术，对斑马鱼的听觉相关基因进行研究，将具有重要意义。

2017年，Schwarzer等[48]利用CRISPR/Cas9技术干扰了Dlx3b和Dlx4b两基因在斑马鱼体内的表达，随后发现,上述两基因对早期感觉毛细胞的正常发育是必需的。2018年，Pei等[49]通过CRISPR/Cas9技术，构建了多种基因突变斑马鱼，并在此基础上开发了可应用于分析感觉毛细胞发育和再生的高通量筛选技术。应用该技术，他们对254种突变的基因进行了筛选，并明确了其中7种基因可特异地影响斑马鱼感觉毛细胞的再生。同年，Zhang等[50]应用CRISPR/Cas9技术构建了Mtu1基因表达缺陷的斑马鱼。该斑马鱼模型表现出听力障碍、惊吓反应与游泳行为异常等。除此之外，上述基因缺陷型斑马鱼内耳中与侧线处毛细胞的数量均明显减少,该研究为耳聋疾病的发病机制提供了新的理论依据。

3.4 转基因技术

转基因技术是指利用现代生物技术，将人们期望的目标基因，经过人工分离、重组后，导入并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的性状的一种技术。应用转基因技术，科研人员可实现斑马鱼听觉器官的特异荧光标记，或构建听觉相关基因表达缺陷的活体动物模型，为听觉领域的研究提供新的实验动物。

2014年，冯晓等[51]利用转基因技术构建了POU4f3基因缺陷的斑马鱼，并以其为实验动物，进一步研究了耳聋基因Gfi与POU4f3的关系。研究发现，POU4f3可调控Gfi的表达，且两基因的表达均与神经组织的发育密切相关。2017年，Li等[52]通用转基因技术构建Cldn7b基因突变的转基因斑马鱼，研究发现，该基因可调控内耳的形成与功能。2018年，Matern等[53]利用转基因技术，构建了一种新型的荧光转基因斑马鱼品系——Tg(myo6b:RiboTag),被血凝素标记的线粒体可特异地在该品系斑马鱼毛细胞内表达。以上述转基因斑马鱼为实验动物，结合免疫共沉淀技术，可方便科研人员研究感觉毛细胞内特异的基因表达情况。同年，Itallia等[54]应用转基因技术，构建了毛细胞上的跨膜蛋白突变体斑马鱼，研究发现，Tmie蛋白可调控Tmc1/2蛋白在毛细胞上的定位。

4 结语

斑马鱼作为一种介于细胞与哺乳动物之间的新型脊椎动物模式生物，在听力研究领域拥有巨大的潜力。以其作为实验动物，有助于科研人员对药物或化合物的耳毒性及耳毒性保护活性进行高通量的快速筛选评价。除此之外，科研人员还可借助斑马鱼模型，对听力相关基因的功能进行深入研究，为人类听觉毛细胞再生这一难题的破解提供新的实验思路与科研数据。目前，随着斑马鱼基因组计划的进一步完善，以及转基因和基因编辑等分子生物学技术的不断涌现，斑马鱼模型在听力研究领域的应用必将更为广泛。