尿IL-18、转铁蛋白和β2微球蛋白在新生儿窒息致急性肾损伤早期诊断中的价值

张丽亚 陈黎丽 罗芳

新生儿窒息可致多脏器功能损伤甚至衰竭，是我国新生儿死亡和致残的重要因素之一[1]。新生儿窒息常导致急性肾损伤（AKI），并可发展成急性肾功能衰竭[2]。目前临床上主要采用血清肌酐（Scr）、尿量等指标进行诊断，但其灵敏度较差，加上新生儿肾功能的影响因素较为复杂，当Scr发生明显变化时，患儿肾功能损害已非常明显，往往失去了早期干预的机会；同时反复抽血检测也会对患儿造成伤害。相对于血液，尿液更容易获取且无创伤。Scr仅反映肾小球滤过功能，但肾滤过功能具有强大的代偿能力，当功能损伤超过50%时Scr才开始升高。然而，尿液指标能更全面反映肾脏功能，如尿微量白蛋白、β2微球蛋白（β2-MG）等。此外，肾损伤时也会分泌一些物质并随尿排出体外，这些物质在尿液中的浓度可反映肾损伤的程度。研究表明，与尿微量白蛋白比较，尿转铁蛋白（TRF）反映肾小球滤过膜的屏障功能受损更灵敏[3]。IL-18是主要由活化的单核细胞、巨噬细胞分泌的前炎症因子，具有免疫诱导功能，当肾损伤时会分泌IL-18并随尿液排出，可反映肾损伤的程度。本研究通过检测尿IL-18、TRF和β2-MG等指标，探讨这些指标对新生儿窒息致AKI早期诊断的价值，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年7月至2018年10月在本院出生的发生窒息合并AKI足月新生儿50例、发生窒息未诊断AKI足月新生儿50例、同期健康的足月新生儿50例（正常对照组）为研究对象。纳入标准：38周≤胎龄＜42周；2.5kg≤出生体重＜4.0kg。排除患有泌尿系统先天畸形、围生期感染等非窒息因素导致影响肾功能的疾病者。AKI的诊断与分级标准参考2012国际改善全球肾脏疾病预后组织关于AKI的指南：48h内Scr≥26.5μmoL/L，已知或推测过去7d内Scr≥基线值1.5倍，或持续6h尿量＜0.5ml/（kg·h）为急性AKI，具体见表1。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集并比较3组对象的一般资料，包括性别、胎龄、体重、出生后Apgar评分（8～10分为正常，0～7分为窒息）、48h Scr变化值、48h尿量等。

1.2.2 实验室检测 （1）尿IL-18、TRF、β2-MG检测：分别留取新生儿出生后 0～6h、6～12h、12～24h、24～48h 等 4个时段的新鲜尿液2ml，1500r/min离心5min，存于-80℃冰箱内备用。Human IL-18 Platinum ELISA试剂盒（ARG80138）由美国 eBioscience公司提供，在 Wallac Victor 1420型酶标仪460nm读取结果；尿β2-MG检测试剂（20180327）由郑州安图生物工程股份有限公司提供，使用中国Autolumo A2000Plus全自动生化分析仪以磁微粒化学发光法进行检测；尿TRF检测试剂（M808234）由贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司提供，使用美国贝克曼库尔特公司提供的IMMAGE 800免疫分析仪以免疫透射比浊法进行检测。（2）Scr检测：对于新生儿窒息者，尽早抽取静脉血2ml，4 000r/min离心5min，检测 Scr；抽血 48h 后再取静脉血 2ml，检测 Scr。Scr检测试剂（20180402）由宁波美康生物科技有限公司提供，使用美国贝克曼AU680型全自动生化分析仪进行检测。

1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内不同时段比较采用重复测量的方差分析，两两比较采用LSD-t检验。不同时间段尿IL-18、β2-MG、TRF对新生儿窒息致AKI的诊断效能评价采用ROC曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 AKI诊断与分级标准

2 结果

2.1 3组对象一般资料比较 3组对象性别、胎龄、体重比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；Apgar评分、48h Scr变化值、48h尿量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

表2 3组对象一般资料比较

2.2 3组对象不同时段尿IL-18、β2-MG、TRF比较 除出生后0～6h尿TRF外，其余不同时段尿IL-18、β2-MG、TRF3组对象比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。窒息合并AKI组4个时段尿IL-18、β2-MG、TRF比较，以及窒息未诊断AKI组4个时段尿β2-MG、TRF比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；正常对照组4个时段尿IL-18、β2-MG、TRF比较，以及窒息未诊断AKI组4个时段尿IL-18比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 3。

表3 3组对象不同时段尿IL-18、β2-MG、TRF比较

2.3 窒息合并不同AKI分级患儿不同时段尿IL-18、β2-MG、TRF比较 依据2012国际改善全球肾脏疾病预后组织关于AKI的指南，AKIⅠ级23例，Ⅱ级19例，Ⅲ级8例。随着AKI分级增高，各时段尿IL-18、β2-MG及TRF不断增高；随着尿标本留取时间的延长，AKI患者尿IL-18、β2-MG及TRF不断增高，见表4。

2.4 不同时间段尿IL-18、β2-MG、TRF对新生儿窒息致AKI的诊断效能 0～6h尿IL-18的诊断效能最高，AUC为0.65；6～12h尿β2-MG的诊断效能最高，AUC为0.85；12～24h尿 β2-MG、TRF 的诊断效能最高，AUC 均为 0.96；24～48h 尿 β2-MG、TRF 的诊断效能最高，AUC均为1.00。3者联合诊断效能均优于单项指标，0～6h、6～12h、12～24h、24～48h 的 AUC 分别为 0.77、0.96、1.00、1.00，见图 1。

3 讨论

新生儿窒息后并发症往往累及多器官，主要包括心、脑、肾等[4]。新生儿窒息后，机体血液通过潜水反射重新分布并优先保证心、脑、肾上腺等重要脏器的血供，而通往肾脏组织的血流迅速减少，易造成肾损伤。据报道，我国新生儿窒息发生率约为5%[5]；而窒息又是肾损伤的第一病因[6]。对于肾损伤，早期诊断与干预是降低肾损伤病死率的关键。但不少患儿虽出现不同程度的急性肾功能异常，但未达到肾衰竭的标准，可能失去早诊断早干预的时机，最终可发展为终末期肾病。近年来，国际上用AKI的标准取代传统的急性肾功能衰竭，为肾脏早期损伤的诊断提供依据。AKI表现为突然或连续性的肾功能衰退，涵盖了从肾功能微小改变到肾功能衰竭的整个过程。据报道，新生儿窒息致急性肾功能衰竭的比例接近10%，而AKI的比例超过60%[7-8]。

表4 窒息合并不同AKI分级患儿不同时段尿IL-18、β2-MG、TRF比较

图 1 不同时间段尿 IL-18、β2-MG、TRF 诊断新生儿窒息致 AKI的 ROC 曲线（a：0～6h，AUCIL-18=0.65，AUCβ2-MG=0.62，AUCTRF=0.57，AUC联合 =0.77；b：6～12h，AUCIL-18=0.79，AUCβ2-MG=0.85，AUCTRF=0.76，AUC 联合 =0.96；c：12～24h，AUCIL-18=0.89，AUCβ2-MG=0.96，AUCTRF=0.96，AUC联合 =1.00；d：24～48h，AUCIL-18=0.96，AUCβ2-MG=1.00，AUCTRF=1.00，AUC 联合 =1.00）

2001年Bellomo等[9]首次提出了AKI。2002年急性透析质量专家组提出了AKI的分级标准[10]，并将其分为风险期（R）、损伤期（I）、衰竭期（F）、失功能期（L）和终末肾病期（E），简称RIFLE分级标准。由于其分级诊断主要依据Scr较基线值升高倍数和eGFR确定，而Scr与GFR变化并不完全一致；加上很多患者并无基础肾功能指标监测值，依据Scr较基线值升高倍数进行诊断与分级存在问题。为提高诊断的灵敏度，2005年AKI工作网络（AKIN）对RIFLE分期标准进行简化，即AKIN诊断标准。RIFLE标准强调与以往状态的比较以及肾功能变化的累积效应，而AKIN标准强调短期内上升幅度及肾功能变化速度[11]。2012年国际改善全球肾脏病预后组织在RIFLE和AKIN标准基础上对AKI标准再次进行修订并发表了AKI指南，明确了急性AKI的诊断标准；当患者Scr和尿量符合不同分级时，选择最高分级。但该标准评价肾功能的主要指标是Scr和尿量，由于新生儿Scr和尿量受多种因素影响，不同个体新生儿的尿量差异很大，加上新生儿Scr的正常参考值尚无统一标准，基线值难以确定；因此，目前该诊断标准用于新生儿AKI的评价受到限制。

目前Scr检测仅能反映肾小球滤过功能受损程度，而肾小球滤过功能具有强大的代偿能力，只有当滤过功能损伤超过50%时Scr才升高。因此，可认为在发生窒息而未达到AKI诊断标准的患儿中，有相当一部分患儿实际上已发生肾损伤。肾脏功能包括肾小球滤过功能和膜屏障功能，以及肾小管的重吸收、尿液浓缩及酸碱调节功能等。多项研究结果表明，肾小管功能在反映肾损伤时较肾小球更为灵敏[12-13]。另外，当肾损伤时会分泌一些物质并随尿液排出体外，因此本研究以反映肾小球滤过膜屏障功能受损的TRF、反映肾小管重吸收功能的β2-MG以及肾损伤时分泌的IL-18作为观察指标，探讨其在新生儿窒息致肾损伤早期诊断中的价值。TRF为单链糖蛋白，在肝脏内合成，生物半衰期7～10d，分子质量与白蛋白接近，多项研究表明其可作为反映肾小球膜屏障功能的标志物[14-15]。此外，TRF所带负电荷较微量白蛋白少，更易通过带负电荷的肾小球滤过膜，在检测早期肾小球损伤方面较微量白蛋白更灵敏。尿β2-MG是细胞表面人白细胞抗原的β链（轻链）部分，分子质量11 800，由99个氨基酸组成的单链多肽。它可从肾小球自由滤过，99.9%在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏，故在正常情况下尿β2-MG浓度很低。当肾小管受损时，尿β2-MG明显增高，是反映肾小管重吸收功能的理想指标[16]。IL-18是一种主要由活化的单核巨噬细胞分泌的前炎症细胞因子，能诱导包括IFN-γ在内的多种细胞因子，还可通过细胞凋亡蛋白酶-1（Caspase-1）的激活参与炎症及免疫反应，具有重要的免疫调节功能，参与多脏器局部缺血性损伤等过程[17]。Caspase-1和IL-18主要表达肾小管上皮细胞中，当肾脏受到血流灌注下降等急性损伤时，Caspase-1激活IL-18前体并裂解为有活性的IL-18，对肾脏起保护作用，同时增高的IL-18随尿排出。多项研究结果显示，尿IL-18指标对多种因素引起的AKI具有良好的诊断与预后评估价值，且尿IL-18增高远早于Scr的增高[18-21]。本研究结果显示，与正常对照组比较，窒息未诊断AKI组各时间段尿TRF、β2-MG和IL-18均有不同程度的升高，说明在窒息未诊断AKI患儿中有肾损伤发生。在窒息合并AKI组中，48h内尿TRF、β2-MG和IL-18均随尿标本留取时间的延长而增高。在窒息未诊断AKI组中，3项指标在6～12h尿液中浓度均高于0～6h，之后除IL-18下降不明显外，TRF、β2-MG均有不同程度的下降；提示在窒息未诊断AKI患者0～6h尿液中，3项指标均会出现明显升高过程，随后回落。在窒息未诊断AKI组、窒息合并AKI组中，0～6h尿IL-18、β2-MG均有所增高。ROC曲线分析发现，0～6h尿IL-18在区分窒息未诊断AKI与窒息合并AKI的诊断效能最佳；分析原因可能是IL-18为前炎症细胞因子，在肾脏组织细胞发生凋亡以及肾脏功能受损前就已升高。窒息未诊断AKI组与窒息合并AKI组6～12h尿TRF开始升高，提示可能在窒息引起的AKI中，肾小球的膜屏障功能受损出现的时间相对较晚；此外，该时段尿β2-MG的诊断效能优于 IL-18。12～24h、24～48h 尿 TRF、β2-MG 诊断效能均优于IL-18；原因可能是在窒息未诊断AKI患儿尿IL-18保持较高水平。同时发现，3者联合诊断效能明显高于单一指标；12～24h尿液指标检测结果就能将窒息未诊断AKI与窒息合并AKI患儿完全区分，明显缩短了AKI的诊断时间。此外，对不同AKI分级患儿尿TRF、β2-MG和IL-18分析发现，3项指标浓度随分级增高而增高，提示具有反映病情进展的作用。

综上所述，尿IL-18、β2-MG和TRF在新生儿窒息致AKI早期诊断中具有一定的临床价值，0～6h尿IL-18诊断效能最高，之后其诊断效率低于TRF和β2-MG，3者联合诊断效能优于单项指标，可明显缩短诊断时间，同时采取尿液作为检测标本可减少对患儿的伤害。但是，严重肾损伤患儿可出现持续无尿；另外由于新生儿处于特殊代谢时期，各指标的个体差异较大，对最终结果可能造成影响，在一定程度上具有局限性。