小檗碱激活AMPK改善去卵巢小鼠肝脂代谢

魏 明,甘 露,王雯智,于 玮,魏 荣

(1西安医学院药理学教研室,西安 710021;2陕西省人民医院妇科;3陕西省榆林市第二医院;*通讯作者,E-mail:9790148@qq.com)

随着社会的进步,女性的平均寿命逐步增加,老龄化的女性越来越多,绝经后肥胖的发病率也日趋增加,绝经后肥胖与胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关,严重影响绝经后妇女的健康。

小檗碱(berberine,Ber)是中草药黄连的主要活性成分。研究发现,Ber具有一系列药理作用,如脂质调节,抗炎和降血糖作用[1,2]。但目前小檗碱对去卵巢(OVX)模型小鼠肝脏脂代谢研究未见相关报道,因此本实验采用OVX小鼠作为绝经后动物模型,观察小檗碱对去卵巢小鼠脂代谢的改善作用,并探讨其作用机制,为小檗碱在绝经后肥胖女性中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 去卵巢动物模型的建立

在空军军医大学购买并培养30只健康的10周龄C57BL/6雌性小鼠,小鼠适应1周后,腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,背部消毒,依次切开皮肤和皮下组织及腹膜,在输卵管和子宫角的连接处结扎,移除卵巢。在sham组中,卵巢没有被移除,只有部分腹部脂肪组织被移除。实验期间小鼠的处置符合西安医学院伦理委员会颁布的实验动物伦理标准。

1.2 实验分组情况及处理

将30只雌性C57BL/6小鼠随机分成3组:sham组、OVX和OVX+小檗碱组。sham和OVX组每天用生理盐水灌胃,而小檗碱治疗组以小檗碱灌胃,以50 mg/kg的剂量给药,治疗时间为8周。实验过程中,每2周称取小鼠体质量,小鼠处死前眼球取血检测血清甘油三酯和游离脂肪酸,处死后取肝脏称重并计算肝脏指数,取部分肝组织进行油红O染色,部分用于Western-blot检测。

1.3 小鼠体质量记录

实验过程中,每2周称量小鼠体质量。

1.4 标本采集

最后一次给药后称重,禁食8 h,1%戊巴比妥钠(0.15 ml/20 g)腹腔注射麻醉,眼球收集血液,分离血清,-20 ℃保存。取肝脏称重,计算肝脏脏器指数=肝脏重量/小鼠体质量,部分组织-80 ℃保存,部分进行油红O染色。

1.5 肝油红O染色

油红O是一种脂溶性染料,可特异性地染色组织中的TAG等中性脂肪。4%中性甲醛固定冰冻切片30 min,蒸馏水冲洗,60%异丙醇漂洗3 min,油红O避光染色15 min,60%异丙醇溶液漂洗1 min,蒸馏水洗,苏木素染核1 min,蒸馏水洗,封片。

1.6 比色法测定血清甘油三酯和游离脂肪酸

取血清7 μl,加入700 μl工作液,混合并置于37 ℃水浴中10 min,使用7 μl蒸馏水和标准溶液7 μl作为对照。与样品平行操作,以空白管调零,用酶标仪于546 nm处比色测定各管吸光度值,与标准液比较计算样品中甘油三酯含量。TG(mmol/L)=AT/AS×2.26。另测定血清游离脂肪酸使用游离脂肪酸检测试剂盒,测定方法同上。

1.7 肝p-AMPK-α蛋白检测

从肝组织中提取总蛋白,BCA法蛋白定量,配制12%分离胶和6%浓缩胶;点样孔中加入50 μg蛋白样品,加入电泳缓冲液,120 V 20 min后将电压改成160 V 120 min;200 mA恒流转膜2 h;NC膜丽春红染色,并按各目的蛋白所在位置剪膜。1 ∶1 000兔抗小鼠p-AMPK-α孵育过夜,羊抗兔IgG二抗孵育1 h,化学发光成像,灰度分析,采用p-AMPK-α/β-actin表示蛋白相对表达量。

1.8 数据分析

2 结果

2.1 小鼠体质量

术后8周,OVX小鼠的体质量显著高于sham组小鼠(P<0.05)。但小檗碱治疗8周后能显著减少OVX小鼠的体质量(P<0.05,见图1)。

与sham组比较,#P<0.05;与OVX组比较,*P<0.05图1 各组小鼠体质量的变化 (n=10)Figure 1 Changes of weight of mice in each group (n=10)

2.2 小鼠肝脏指数

与sham组小鼠相比,OVX组小鼠肝脏指数明显升高(P<0.05);与OVX组相比,小檗碱处理后小鼠的肝脏指数显著降低(P<0.05,见图2)。

与sham组比较,#P<0.05;与OVX组比较,*P<0.05图2 各组小鼠肝脏指数统计图 (n=10)Figure 2 Comparison of liver index among three groups (n=10)

2.3 肝组织油红O染色

8周后,与sham组相比,OVX小鼠肝组织中出现更多的脂滴,OVX小鼠小檗碱处理后,肝组织中的脂滴显著减少(见图3)。

2.4 各组脂代谢指标的比较

与sham组相比,OVX组血清甘油三酯和游离脂肪酸显著增加(P<0.05);与OVX组小鼠比较,小檗碱治疗后,小鼠血清甘油三酯和游离脂肪酸较OVX明显降低(P<0.05,见图4)。

图3 小檗碱改善OVX小鼠肝脂质积累 (标尺=50 μm)Figure 3 Berberine improves liver lipid accumulation in OVX mice (bar=50 μm)

与sham组比较,#P<0.05;与OVX组比较,*P<0.05图4 小檗碱改善OVX小鼠脂代谢 (n=10)Figure 4 Berberine improves lipid metabolism in OVX mice (n=10)

2.5 p-AMPK-α蛋白的表达

与sham组相比,OVX组小鼠肝脏p-AMPK-α蛋白表达明显减少(P<0.01);与OVX组相比,小檗碱组p-AMPK-α蛋白明显增加(P<0.01,见图5)。

3 讨论

绝经后雌激素的缺乏通常伴随着体质量的增加[3]。研究表明,卵巢功能的降低可以增加代谢综合征的发病率[4]。本实验的结果显示,卵巢切除小鼠的体质量增加显著高于假手术组,卵巢切除小鼠肝脏质量也明显高于假手术组。其原理可能是卵巢切除术后,雌激素大大减少,血液LDL、总胆固醇升高,肝细胞脂滴积聚,肝脏脂质增加,肝脏质量增加。

与绝经前妇女相比,绝经后妇女在腹部聚集了大量脂肪。因此,与肥胖相关的疾病,如糖尿病、冠心病等代谢性疾病在绝经后发病明显上升[3]。

图5 各组小鼠肝脏p-AMPK-α蛋白的表达Figure 5 Expression of p-AMPK-α protein in liver in each group

OVX小鼠模拟了人类绝经和雌激素缺乏,以及导致肥胖及相关的综合征,包括脂肪炎症、高血糖及脂肪肝[5]。我们的结果与之前的研究一致[5]。与sham组相比,OVX组血清甘油三酯和游离脂肪酸显著升高。红油染色提示肝脏中脂滴明显增加,并出现脂肪肝。通过小檗碱治疗后,OVX小鼠血甘油三酯及游离脂肪酸明显下降,肝脏切片油红O染色脂肪滴明显减少。研究报道小檗碱能减轻高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝脏脂肪变性和氧化应激损伤,其作用机制可能是通过上调SIRT1蛋白的表达,从而抑制p53的乙酰化[6]。但是没有文献报道小檗碱对绝经后肥胖以及脂肪肝的治疗作用。

脂肪细胞肥大和炎症导致脂肪细胞功能障碍,导致肥胖和相关疾病,如胰岛素抵抗、2型糖尿病和脂肪肝[7]。OVX组循环中甘油三酯增加,诱导脂肪滴积聚,但小檗碱治疗后改善血脂异常以及肝脏甘油三酯积聚,使内脏脂肪的慢性炎症环境减轻,促进内脏脂肪的分解,并抑制内脏脂肪的合成。

AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)是脂代谢的关键调控者,AMPK最具有特征性靶点是在肝脏和下丘脑的脂肪酸合成通路。AMPK磷酸化的激活可以通过降低脂肪酸合成酶的表达来减少脂肪酸的产生[8-10]。在本实验中,OVX组小鼠肝脏p-AMPK-α蛋白表达明显减少,小檗碱给药8周后,OVX小鼠肝脏p-AMPK-α蛋白明显增加。这表明小檗碱可能通过激活p-AMPK-α来改善OVX小鼠肝脏的脂肪代谢。

在模拟女性绝经的OVX小鼠模型中,小檗碱能够抑制OVX小鼠肥胖,同时改善OVX小鼠肝脏脂代谢。这些结果表明,小檗碱可能有益于绝经后肥胖及脂代谢紊乱的治疗,需进一步研究为绝经后肥胖患者提供用药选择。