基于基因表达数据库筛选膀胱癌中差异表达的环状RNA

吴文婧,赵车冬,庞 欢,赵 华,申 涛,陈 葳

(西安交通大学第一附属医院检验科,西安 710061;*通讯作者,E-mail:chenweixjtu2014@126.com)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,全球范围内每年新增的膀胱癌患者超过33万例,死亡病例多于3万例[1]。在我国,膀胱癌发病率在泌尿系统中居于首位,且呈逐年上升趋势,严重威胁人类的健康和生命[2,3]。膀胱癌生物学行为复杂,且治疗后易复发,容易发生侵袭和转移,其发病机制涉及大量基因表达、功能异常及多种信号通路的改变。环状RNA(circular RNA, circRNA)是具有闭合环状结构的一类新型RNA[4]。近年来,circRNA被发现与包括肿瘤在内的多种疾病相关,通过多种机制参与疾病的发生发展[5-7]。但是与膀胱癌相关的circRNA目前研究尚不多见[8]。

本研究基于基因表达数据库(GEO),利用生物信息学方法对膀胱癌相关circRNA进行筛选,并对其相关通路进行预测。本研究结果对于深入研究膀胱癌的分子机制,寻找新的诊断标志物和有效治疗靶点,提供了一定研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

从GEO数据库中筛选含有膀胱癌和癌旁组织基因表达信息的数据集,发现膀胱癌circRNA表达谱数据集GSE92675,该数据集来自Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1芯片数据共8张,分别为4例膀胱癌组织和4例配对的癌旁组织,该芯片可检测5 397条circRNA。

1.2 方法

1.2.1 数据来源 从NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载膀胱癌circRNA表达谱数据集GSE92675的数据,使用R软件包对GEO92675芯片数据进行分析,通过差异表达倍数和P值进行筛选,采用t检验,筛选两组样本间差异表达的circRNA。

1.2.2 生物信息学分析 通过生物信息学网站(http://www.circbase.org;http://starbase.sysu.edu.cn/)预测与上调或者下调表达的circRNA相互作用的靶microRNA。应用Cytoscape软件构建circRNA-miRNA网络。使用FunRich软件对microRNA的靶基因进行预测并进行基因本体论(gene ontology,GO)生物学通路富集分析。

2 结果

2.1 膀胱癌中差异表达circRNA的筛选

将肿瘤组和正常组芯片分析数据进行比较,从芯片数据中筛选出3 423个差异表达的circRNA,首先对校正的P值进行筛选,筛选条件为P校正<0.01,经过筛选,得到670个circRNA。再通过筛选差异表达倍数(fold change,FC),选择|logFC|>1.5的circRNA,得到153个circRNA,其中表达上调的有114个circRNA,表达下调的circRNA有39个(见图1)。膀胱癌中上调10倍以上的circRNA,及表达下调10倍以上的circRNA见表1、2。

2.2 差异表达circRNA在芯片所用组织中的表达谱

选取表达上调和下调差异倍数前5位的circRNA,从GEO数据库中调取其表达量,如图2所示,has-circ-0000144、0000658、0023642、0002623、0032821在膀胱癌组织中高表达,而has-circ-0003266、0092342、0007158、0028173、0009361在膀胱癌组织中的表达低于癌旁正常组织。

蓝色点代表符合筛选条件的circRNA P校正<0.01,|logFC|>1.5,红色点代表不符合筛选条件的circRNA图1 膀胱癌差异表达circRNA火山图Figure 1 Volcano plots of differentially expressed circRNAs of bladder cancer

表1 膀胱癌中表达上调10倍以上的circRNA

Table 1 Upregulated circRNAs with over 10 fold change in bladder cancer

circRNA相关基因倍数Phsa-circ-0000144SLAMF653.640.000000924hsa-circ-0000658MCTP249.990.00000013hsa-circ-0023642UVRAG40.500.000000112hsa-circ-0002623VANGL139.360.000000916hsa-circ-0032821CEP12833.740.00000328hsa-circ-0008035EXT131.760.000000924hsa-circ-0005273PTK230.890.000073hsa-circ-0084171FNTA30.790.00000186hsa-circ-0058058ATIC29.300.000000924hsa-circ-0061265None26.570.00000226hsa-circ-0001336EEFSEC21.870.00146hsa-circ-0041103TCF2521.360.00000264hsa-circ-0047322TAF4B20.200.00000013hsa-circ-0072088ZFR15.520.0000756hsa-circ-0008558LONP214.380.00000013hsa-circ-0041151RPH3AL12.630.00000013hsa-circ-0011385EIF3I12.080.00000583hsa-circ-0060219SOGA111.110.0000053hsa-circ-0000520RPPH110.480.000225hsa-circ-0003528SEC24A10.450.00067

表2 膀胱癌中表达下调10倍以上的circRNA

Table 2 Down-regulated circRNAs with over 10 fold change in bladder cancer

circRNA相关基因倍数Phsa-circ-0003266LRIG117.330.0000876hsa-circ-0092342RPL27A14.230.000265hsa-circ-0007158FAM169A10.470.0000613hsa-circ-0028173ATP2A210.370.0000136

图2 差异表达circRNA在芯片所用组织中的表达Figure 2 Expression of circRNAs with differentially expression in the tissues of chip

2.3 circRNA-SOGA1的生物信息学分析结果

对上调或下调的circRNA进行相关文献检索分析,发现上调倍数为11倍的circRNA-SOGA1的相关基因SOGA1(suppressor of glucose 1)可能参与肿瘤的发生发展,因此对circRNA-SOGA1作进一步分析。通过生物信息学网站starbase预测与circRNA相互作用的靶microRNA,结果提示与circRNA-SOGA1相互作用的miRNA有103个,利用Cytoscape构建其circRNA-miRNA相互作用网络(见图3A)。FunRich软件对该103个miRNA的靶基因进行预测,并进行GO分析,分析结果发现,这些miRNA的靶基因主要参与蛋白多糖介导的信号通路、ErbB受体信号通路、VEGF和VEGFR信号通路等(图3B)。

3 讨论

近年来,随着膀胱癌发病率的逐年增长,如何阻止膀胱癌的发生发展是其治疗的关键问题,积极探究膀胱癌发生发展的具体分子机制并寻找新的治疗靶点具有十分重要的意义。

研究表明,circRNA可以作为miRNA的分子海绵,通过吸附miRNA,促进miRNA的靶基因的表达[9]。在本研究中,我们通过分析GEO数据库中膀胱癌相关的circRNA数据集,对膀胱癌相关circRNA进行筛选,结果发现表达上调的有114个circRNA,表达下调的circRNA有39个。提示circRNA可能参与了膀胱癌的进展。有研究发现circRNA在膀胱癌的发生发展中发挥着重要作用[10,11],可以通过circRNA-miRNA-mRNA轴促进或抑制膀胱癌细胞的生长和进展。本研究中利用生物信息学方法发现的在膀胱癌组织上调或下调的circRNA是否在膀胱癌中发挥作用仍需进一步实验验证。

图3 circ-SOGA1调控网络分析Figure 3 Analysis of circ-SOGA1 regulatory network

本研究中,我们对上调倍数为11倍的circ-SOGA1作进一步的深入分析。circ-SOGA1定位于20号染色体,其相关基因为SOGA1,目前对SOGA1的研究尚不多见。有研究发现,SOGA1在肿瘤干细胞中可以增加线粒体的生物合成,从而增加线粒体质量[12]。SOGA1还表达于人乳头瘤病毒197型E6和E7相关细胞蛋白[13]。Kruse等[14]在研究微管相关蛋白CLASP2蛋白的相互作用网络时,发现SOGA1与CLASP2和tubulin共定位,证实SOGA1可能作为一种新的微管相关蛋白发挥细胞骨架的代谢功能。Habieb等[15]的研究探讨血循环中的RNA在肝细胞癌中的诊断作用,结果发现血清SOGA1 mRNA在肝癌患者中表达升高,是肝细胞癌的一个独立预后因素。但是SOGA1在膀胱癌中的功能尚需进一步研究。circ-SOGA1是来源于SOGA1的环状RNA,在膀胱癌中是否发挥作用还需要进一步实验证实。而我们进一步对circRNA-SOGA1预测其相互作用的miRNA和靶基因,构建circRNA-miRNA互作网络,并对相关靶基因进行GO分析,结果显示这些靶基因在膀胱癌细胞中可能参与蛋白多糖、ErbB受体、VEGF和VEGFR信号通路等多条信号通路。因此推测circRNA-SOGA1可能通过影响靶miRNA的活性或竞争结合靶miRNA来调节miRNA与靶mRNA的作用,进而通过多种信号通路和生物进程来影响膀胱癌的发生发展。但是生物学信息分析结果仍需经过实验验证,后续研究中我们将对circ-SOGA1在膀胱癌细胞中进行功能学验证,并阐明其参与的信号通路。

综上所述,本研究构建了膀胱癌相关circRNA的互作网络,为揭示膀胱癌发生发展的分子机制提供一定的理论基础。对circRNA功能及作用机制的研究,有助于探寻新的膀胱癌候选诊断、治疗靶点,并揭示膀胱癌进展过程中的生物学机制。