褪黑素对小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响

徐高青，李志强，王友元，王 军，吕文发

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省反刍动物繁育生物技术与健康养殖工程实验室，吉林长春 130118）

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin）是一种主要由松果体合成的神经内分泌激素，能够维持哺乳动物的昼夜节律[1-2]。褪黑素参与多种生理功能，包括抗氧化、抗炎、免疫调节、血管舒缩和癌症预防[3-5]。睾丸间质细胞是产生雄性激素的主要细胞，在精子发生和成熟过程中发挥着重要作用[6]。睾丸间质细胞的凋亡与睾丸功能息息相关，睾丸间质细胞缺乏会使生精细胞大量凋亡，从而导致睾丸生精功能障碍[7]。研究表明，在小鼠睾丸内注射褪黑素抑制了睾酮的合成和分泌，同时显著降低了小鼠睾丸间质细胞分泌的睾酮水平以及睾酮合成关键调节基因STAR、P450SCC（CYP11A1）和3β-HSD的表达水平[8-9]，但其对小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响尚不清楚。本实验在小鼠睾丸间质细胞培养过程中添加不同浓度褪黑素，利用MTT 法检测细胞活力，细胞流式术检测细胞凋亡率，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白印迹（Western Blot）技术检测凋亡相关基因BAX、BCL-2表达水平，从而分析褪黑素对小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理 实验选择小鼠睾丸间质细胞系（TM3，武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0234）作为研究对象。配制含有5%胎牛血清、2.5%马血清和1%青霉素/链霉素的细胞培养液用于细胞的体外培养。在处理细胞时，为消除血清的强烈刺激，换用无血清培养液培养，在对照组中直接加入培养液，不同浓度处理组中分别在培养液中加入1、10、100、1 000 ng/mL 的褪黑素（SIGMA，M5250-1G），培养36 h 后，进行后续实验。

1.2 MTT 法检测细胞活力 将TM3 细胞传代至96 孔板，用不同浓度褪黑素处理36 h 后，使用MTT 法检测细胞活力。每孔加入MTT 试剂（BioFroxx，3580MG250）20 μL；37℃孵育4 h 后，弃上清，加入150 μL DMSO（二甲基亚砜），振荡至蓝紫色结晶完全溶解，使用酶联免疫检测仪在吸光度490 nm 处检测细胞活力，选择最佳处理时间点。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 按照凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen，556547）要求，将处理好的细胞用PBS 清洗后，使用胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，再次使用PBS 缓冲液清洗2～3 次，加入200 μL 1×Binding Buffer、PI 和FITC 各5 μL，充分混匀，37℃孵育15 min，再加入200 μL 1×Binding Buffer，过膜至流式管中，在1 h 内使用流式细胞仪检测。

1.4 实时荧光定量PCR 检测 使用RNAiso Plus（TaKaRa，9109）进行RNA 提取，根据TaKaRa 反转录试剂盒要求，将RNA 反转录为cDNA。本实验所用基因引物由上海生工生物技术有限公司设计及合成，引物序列见表1。利用荧光定量PCR 仪检测对照组和不同浓度褪黑素处理组凋亡相关基因及增殖相关基因表达。20 μL 反应体 系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上游引物 0.4 μL（0.2 μmol/L）、下游引物 0.4 μL（0.2 μmol/L）、ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 2 μL，ddH2O 补足至 20 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，59℃退火34 s，扩增40 个循环，95℃复性15 s。运用 2-△△Ct方法进行数据分析。

1.5 Western Blot 收集处理后的细胞，加入蛋白裂解液进行总蛋白提取，根据BCA 试剂盒说明书（碧云天）进行蛋白浓度检测。配制15%聚丙烯酰胺凝胶，上样进行电泳，采用半干转法转膜，转膜条件0.12 A 28 min。采用BSA 封闭1.5 h，1∶1 000 加入一抗，即兔抗BAX（abclonal，A12009）和BCL-2（abclonal，A11025），4 ℃孵育过夜，TBST 洗3 次，每次5 min。1∶10 000二抗（羊抗兔IgG）室温孵育1 h，TBST 洗3 次，每次5 min。最后用ECL 发光液显影，用Tanon Gis 软件进行灰度值分析，β-actin作为内参。

表1 基因引物

1.6 统计分析 所有实验均重复3 次，数据用平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 软件进行单因素方差分析，比较组间差异性，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对小鼠睾丸间质细胞活力的影响 如图1 所示，与对照组相比，10 ng/mL（P＜0.01）和100 ng/mL（P＜0.05）褪黑素均提高了小鼠睾丸间质细胞活力，1 000 ng/mL 褪黑素处理后，细胞活力无显著性改变。

2.2 褪黑素对小鼠睾丸间质细胞凋亡率的影响 如图2所示，与对照组相比，10 ng/mL 褪黑素处理后，细胞凋亡率极显著下降（P＜0.01）；100 ng/mL 褪黑素处理后细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）。1 ng/mL 和1 000 ng/mL褪黑素处理后细胞凋亡率与对照组差异不显著。

图1 小鼠睾丸间质细胞活力

图2 小鼠睾丸间质细胞凋亡率

2.3 褪黑素对小鼠睾丸间质细胞凋亡相关基因的影响由图3 可知，与对照组相比，10 ng/mL 褪黑素下调了促凋亡基因BAXmRNA 表达水平（P＜0.01），上调了抑凋亡基因BCL-2mRNA 表达水平（P＜0.01）。

图3 凋亡相关基因BAX、BCL-2 mRNA 表达量

2.4 褪黑素对小鼠睾丸间质细胞BAX 和BCL-2 蛋白表达的影响 如图4 所示，10 ng/mL 褪黑素下调了BAX蛋白表达水平（P＜0.01），上调了BCL-2 蛋白表达水平（P＜0.01）。

图4 凋亡相关蛋白BAX、BCL-2 表达水平

3 讨 论

睾丸间质细胞是睾丸中最重要的细胞之一，对精子的发生和睾丸发育具有重要作用。研究表明，睾丸间质细胞的凋亡严重影响动物的繁殖性能[2]。近年来，褪黑素的抗凋亡作用已经在多种细胞中被证明，但在睾丸间质细胞中的研究较少。本实验结果显示，褪黑素可降低小鼠睾丸间质细胞凋亡，对细胞具有保护作用，这与实验室前期在鸡睾丸间质细胞中的研究结果一致[10]。相关研究表明，褪黑素能够通过其受体MT1 和MT2 抑制牛卵巢颗粒细胞凋亡，并且可缓解由β-玉米赤霉烯醇和HT-2 毒素诱导的细胞凋亡和氧化应激[11-12]。Ma 等[13]研究发现，褪黑素降低了小鼠心肌细胞的凋亡水平以及血清肌酸磷酸激酶和乳酸脱氢酶的分泌水平，上调SIRT1和抑凋亡基因BCL-2表达，并下调促凋亡基因BAX、Caspase-3的表达。在化疗实验中，褪黑素能够降低睾丸细胞凋亡，对精子具有保护作用[14]。

对于褪黑素的抗凋亡机制，目前已有研究表明，褪黑素可通过Nrf2 信号通路来发挥作用，提高线粒体膜电位（MMP）和BCL-2mRNA 和蛋白表达，降低Caspase-3 活性和促凋亡基因表达，减轻氯化铝诱导的大鼠脾胀细胞凋亡[15]。此外，褪黑素还通过上调SIRT1表达，并促进细胞自噬，从而降低终板软骨细胞的凋亡和钙化[16]。

综上所述，褪黑素能够影响细胞的凋亡水平，从而调节动物机体的生理过程。本研究结果表明，褪黑素能够提高小鼠睾丸间质细胞活力，上调抑凋亡基因BCL-2mRNA 和蛋白表达，下调促凋亡基因BAXmRNA 和蛋白表达，抑制小鼠睾丸间质细胞凋亡，但其抗凋亡机理尚不明确，还需要进一步研究。