牛至油和过瘤胃蛋氨酸组合添加对奶牛瘤胃微生物蛋白产量与养分消化率的影响

丁大伟，滕乐帮，高许雷，吕永艳，孙国强*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.平度市农业农村局，山东青岛 266700；3.青岛市崂山区农业农村局，山东青岛 266061）

牛至油（Oo）又名牛至香酚、皮萨草、香芹酚等，是由天然植物牛至中提取的挥发油，亦可人工合成，主要成分是百里香酚、香芹酚等酚类化合物，具有广泛的抑菌杀菌效果[1]。徐方华等[2]利用人工瘤胃进行发酵试验时发现添加Oo 可以降低瘤胃内氨态氮（NH3-N）浓度。林波等[3]在湖羊饲粮中添加Oo 及其主要成分后发现提高了粗蛋白质（CP）的过瘤胃率。蛋氨酸（Met）不仅是反刍动物的主要限制性氨基酸之一[4]，并且是瘤胃内部分微生物的主要限制性氨基酸[5]。王剑飞等[6]在体外发酵试验中分别添加过瘤胃蛋氨酸（RPMet）与Met 后发现培养液中原虫蛋白均显著提高。本课题组前期分别对Oo[7]和RPMet[8]进行了研究，发现两者对奶牛瘤胃微生物蛋白（MCP）产量和饲粮中营养物质表观消化率均有促进作用，并确定了Oo 和RPMet 的最适添加量。但目前关于Oo 和RPMet 联合使用对奶牛瘤胃MCP 产量和消化率的影响鲜有报道。本试验拟在前期试验的基础上，探究Oo 和RPMet 联合使用对奶牛瘤胃MCP 产量和养分表观消化率的影响，以期找到提高瘤胃MCP产量和表观消化率的最佳组合，为Oo 和MCP 在实际生产上联合使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计 本试验选用烟台荷牧园牧业有限责任公司4～5岁、体重（640±25）kg、2～3 胎、产奶量（37.1±0.3）kg、乳成分及泌乳期（90±15）d 的荷斯坦奶牛40 头，随机分为10 个组，每组4 头，对照组（C）饲喂基础日粮，试验组补饲不同水平的Oo 和RPMet，设计方案见表1。每头奶牛每天预留0.5 kg 精料作为载体与Oo 和RPMet 混合后随全混合日粮（TMR）一起饲喂，试验期为75 d（预试期15 d，正试期60 d）。预试期开始时间为2018 年5 月5 日。试验所用的Oo 和RPMet 均购自青岛润博特生物科技有限公司，其中Oo 为白色粉末状物质，其组成为Oo、二氧化硅和淀粉等，Oo 含量≥10%，水分≤12%；RPMet 为白色颗粒状物质（过瘤胃率为85%），其组成为DL-蛋氨酸、二氧化硅等，DL-蛋氨酸≥60%，水分≤12%。

表1 试验设计 g/（d·头）

1.2 饲养管理 采用荷兰进口SAC 全自动挤奶器挤奶3 次（04:00、12:00、18:00），挤奶后30 min 内投喂TMR 料。试验牛按照常规规程进行管理。TMR 组成及营养成分见表2。

1.3 试验样品的采集与处理

1.3.1 TMR 样与粪样的采集与处理 在预试期第1～3 天，正试期第28～30、58～60 天采集TMR 样与每头试验牛的粪样，TMR 样采用五点取样法进行取样。粪样采用全收粪法进行收集，采样时提前将牛床冲洗干净，试验牛排便后及时对粪便进行收集，将当天收集的粪样混合均匀并称重，粪样加10%硫酸进行固氮处理后-20℃冷冻保存，将3 d 内收集粪样的比例混合粪样，四分法进行缩样。收集的TMR 样与粪样65℃烘干后粉碎。

1.3.2 尿样的采集与处理 在预试期的第1～3 天，正试期的第28～30、58～60 天，参考朱雯[9]及张凯祥等[7]收尿方法采集每头试验牛的尿样，尿样加入10%的H2SO4调整尿液的pH（pH＜3），-20℃保存。

1.3.3 主要养分表观消化率的测定 参考文献[10]对TMR 与粪中的干物质（DM）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、CP、钙（Ca）、磷（P）进行测定并计算养分表观消化率。

1.3.4 瘤胃MCP 产量 通过尿中嘌呤衍生物（PD）对瘤胃MCP 产量进行估测[11]。PD 为尿酸与尿囊素的含量之和。用分光光度计测定尿酸（型号UV-1800 PC），酶标分析仪测定尿囊素（型号DNM-9602）。

表2 TMR 组成和营养成分（干物质基础）

其中，X为小肠吸收外源性嘌呤数量（mmol/d）；0.85为肠道吸收的嘌呤转化为尿中PD 的回收率；0.385BW0.75为内源嘌呤衍生物的数量。

瘤胃MCP 产量的计算公式[12]：

其中，6.25 为氮与蛋白质的换算系数；X为小肠吸收外源性嘌呤数量（mmol/d）；70 为每毫摩尔嘌呤的含氮量（mg/mmol）；0.83 为微生物核酸嘌呤的消化率；0.116 为瘤胃微生物总氮中嘌呤氮的比例。以正试期第28～30、58～60 天瘤胃MCP 产量的平均值作为正试期内瘤胃MCP 产量。

1.4 统计分析 试验数据用Excel 2010 软件进行预处理。SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，Duncan´ 法进行多重比较，以P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 Oo 与RPMet 的不同添加量组合对奶牛瘤胃MCP 产量的影响 由表3 可以看出，与对照组相比，ML、LM、HM、LH、MH 组MCP 产量分别提高了13.66%、12.81%、12.28%、12.96%、13.73%（P＜0.05）。MH、ML 组PD 排出量极显著提高，LM、LH、HM、HL、HH、LL 组显著提高。MH 组尿酸显著提高；ML、MH、LH、HM、LM、HL、HH 组的尿囊素显著提高。

2.2 Oo 与RPMet 的不同添加量组合对奶牛饲粮主要养分表观消化率的影响 由表4 可以看出，与对照组相比，MH、HM 组CP 消化率极显著提高，MM、LM、HH显著提高。HH、MH 组NDF 消化率显著提高；HH、MH 组ADF 消化率极显著提高，HL、LL 组显著提高；MH 组DM 消化率显著提高。

3 讨 论

3.1 Oo 与RPMet 的不同添加量组合对奶牛瘤胃MCP 产量的影响 本试验通过PD 对瘤胃MCP 进行了间接测定[11]。张凯祥等[7]研究发现，在饲粮中添加Oo 后奶牛的瘤胃MCP 产量显著增加。有研究发现，饲粮中添加RPMet 可以增加反刍动物瘤胃内纤维分解菌等微生物数量[6,13]。Oo 对瘤胃内不同微生物菌群具有不同的抑制效果，如Oo 对于瘤胃内的超级产氨菌[14]以及甲烷菌[2]具有较强的抑制作用，而对于瘤胃内的真菌抑制作用较弱[3]。抑制超级产氨菌可以减缓瘤胃内NH3-N 的产生速率以及浓度，这可能改变了瘤胃内能氮释放的相对速率以及能氮平衡促进了瘤胃微生物的生长繁殖[15]。Oo在抑制甲烷菌降低瘤胃内甲烷生成的同时，总挥发性脂肪酸（TVFA）升高，丙酸、丁酸比例升高[16]，这可能是Oo 抑制甲烷菌后使得丙酸菌等在氢的竞争中取得优势从而增加了丙酸的生成[17]。Met 是瘤胃内微生物的主要限制性氨基酸之一[5]，因为RPMet 的过瘤胃率并非百分之百，溢出的Met 会刺激瘤胃内微生物的生长繁殖[13]。试验中除MM 组外大体呈现出Oo 中间添加量依次优于低添加量组优于高添加量组的趋势，而RPMet未有明显规律。LL 组MCP 产量较低可能是因为添加量较低而对瘤胃内微生物影响较小。目前关于Oo 与Met对瘤胃微生物的研究多为体外发酵试验。本试验中试验组瘤胃MCP 产量提高与上述试验的结果一致，说明Oo与RPMet 联合使用对奶牛瘤胃微生物的生长繁殖具有促进作用。

表3 添加不同水平组合Oo 和RPMet 对奶牛瘤胃MCP 产量的影响

表4 添加不同水平组合Oo 和RPMet 对奶养分表观消化率的影响 %

3.2 Oo 与RPMet 的不同添加量组合对奶牛饲粮主要养分表观消化率的影响 白乌日汗[16]在体外发酵系统中添加450 mg/L Oo 时发现系统中的DM 降解率显著提高。王娟等[18]利用绵羊研究发现添加4 g/（d·头）Oo时可以显著提高青贮玉米的NDF 降解率。罗雄等[19]在西门塔尔牛饲粮中添加250 g/（d·头）RPMet 后发现饲粮的DM、NDF 和ADF 消化率显著提高。本试验与上述试验结果较为一致，部分试验组DM、CP、NDF、ADF 消化率显著或极显著提高。奶牛对于饲粮中纤维的消化主要依靠于瘤胃内相关纤维分解菌的作用。有研究表明，Oo 并不影响瘤胃内真菌数量，对瘤胃内纤维的降解并无负面影响，并可以有效地抑制瘤胃内超级产氨菌数量并降低瘤胃内NH3-N 浓度[3]，NH3-N 浓度降低的同时提高了瘤胃内氮的留存率进而提高奶牛对CP的利用效率。Met 是瘤胃内微生物的主要限制性氨基酸，并且对瘤胃内R.flavefaciens、B.fibrisolvens等纤维分解菌的生长具有较强的促进作用[13]。由于RPMet过瘤胃率并非百分之百，部分溢出的Met 可能促进了瘤胃内部分微生物的生长。本试验中MH、HH 组NDF与ADF 消化率显著提高，在RPMet 添加量最高时，Oo 的中、高添加量组饲粮纤维消化率较高，其他添加量组合有提高但与对照组相比差异不显著。除MH 组外RPMet 中间添加量组CP 消化率依次优于高添加量、低添加量组，Oo 并未表现出明显规律。Oo 与RPMet 联合添加时与上述试验相比降低了二者单独添加时的用量。Oo 与RPMet 对瘤胃内菌群作用原理不同，但联合使用可以提高奶牛饲粮表观消化率，各试验组中以MH组效果最好。

4 结 论

在本试验条件下，奶牛饲粮中联合添加Oo 和RPMet可以促进瘤胃MCP 产量，提高饲粮主要养分表观消化率。综合考虑上述指标，在本试验条件下，以Oo 13 g/（d·头）、RPMet 27.5 g/（d·头）组合（MH 组）效果最好。