微生物发酵剂对四川风羊腿产品特性的影响

王 卫， 何 丹， 张佳敏， 赵志平， 白 婷， 吉莉莉， 陈 林(成都大学 肉类加工四川省重点实验室， 四川 成都 610106)

0 引 言

风羊腿是我国传统特色腌腊肉制品，产品以羊后腿为原料，经修整、上盐、腌制、自然风干、贮藏成熟等工序制作而成，加工及贮藏期因不同地区在数周至数月[1].研究表明，风羊腿属于aw值为0.70～0.80的典型半干水分食品(IMF)，具有极佳的非制冷可贮藏性[2].其特有风味的形成，主要取决于风干进程中以理化为主导，微生物参与的脂肪和蛋白质分解、氧化等反应，逐渐产生醛、酮、酸等一系列小分子化合物[3].借鉴西式微生物发酵剂干预技术，通过添加微生物发酵剂提升风味和品质，缩短发酵期，实现过程安全可控等，已成为传统腌腊制品目前研究的热点[4-5].

前期研究结果证实，添加微生物发酵剂的产品，其含水量、aw和pH值变化幅度显然更大，发酵进程更快，发酵微生物呈现出极为显著的抑制脂肪氧化和降低硝盐残留作用[6-8].以此为基础，本研究重点对四川风羊腿中的总氮(TN)、非蛋白氮(NPN)、游离氨基酸和风味物含量进行测定分析，以进一步探究发酵剂对产品风味等特性的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料.

实验所用材料包括：羊腿，由四川北牧南江黄羊集团有限公司提供；直投式冻干菌，由德国Chr. Hansen公司提供，菌种组合为肉色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和汉逊德巴利酵母菌.

1.1.2 仪 器.

实验所用仪器包括：TJA-3130N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；ZFD-A5140型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；HP-6890/5973型气相色谱/质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)；LRH-250型生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司).

1.2 风羊腿制作

1.2.1 产品配方及实验组设置.

以羊后腿为原料，每1 000 g肉料添加食盐70 g、亚硝酸钠0.1 g、D-异抗坏血酸钠0.8 g、葡萄糖5.0 g、八角2 g、花椒4 g.设置不添加发酵菌的传统自然风干A组和添加直投式冻干菌的B组.

1.2.2 制作工艺及主要技术参数.

风羊腿的制作工艺及主要技术参数为：修整→上盐→入缸腌制(4 ℃，10 d，其间上下翻动3～4次)→清洗晾挂→修割整形→发酵风干(8～12 ℃，相对湿度50%～65%，26 d，至失重30%～32%)→切段、真空包装→贮藏(6～8 ℃，15 d)→成品.

1.3 产品指标检测

1.3.1 检测指标及方法.

分别对风羊腿的原料(RM)，腌制后(AP)，发酵风干的第2～26 d(FD2至FD26)，以及包装贮藏后成品(PS)按照如下方法进行指标测定：

1)TN含量参照国家标准GB5009.5-2016进行测定.

2)NPN含量测定.样品自然解冻后，剔除可见脂肪和筋膜，绞碎，称取4 g，加入0.05 mol/L的柠檬酸缓冲溶液(pH值为6.0)20mL，在冰浴中用组织捣碎机捣碎3次(22 000 r/min，每次10 s，间隔10 s)，于4 ℃下放置2 h后，于4 ℃下10 000 r/min离心15 min，快速滤纸过滤，在滤液中加入10%三氯乙酸(TCA)20 mL混合均匀，于4 ℃下放置过夜，然后2 500 r/min离心10 min，过滤后收集滤液，按半微量凯氏定氮法测定样品NPN含量.

3)游离氨基酸含量测定.将样品与去离子水按1∶2混合，匀浆后50 ℃水浴40 min，然后在4 ℃下8 000 r/min离心30 min.取750 μL上清液，加入300 μL(2 moL/L)KHCO3，用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生1 h，取出后加入600 μL 1 moL/L HCl终止反应，冷却，高速离心12 000 r/min，10 min.取上清液进样测定.

在色谱分析时，色谱柱为Agilent C18柱，洗脱速度0.8 mL/min，进样体积20 μL，检测波长254 nm，柱温(40±1)℃；流动相A为600 mL乙腈和400 mL超纯水混合，经用0.22 μm水系滤膜过滤，脱气备用；流动相B为11.48 g乙酸钠，0.5 mL三乙胺(TEA)溶解于1 L超纯水中，用1%醋酸调节pH值为6.4，混合均匀后，用0.22 μm水系滤膜过滤.同时，将复合氨基酸标准溶液用0.01mol/L HCl稀释成不同浓度梯度.

4)挥发性风味成分测定.挥发性风味成分参照文献[6]的方法进行测定，并稍作修改，具体步骤为：在风羊腿中段深入表皮1 cm下取样，将肉样剪碎后，准确称取3.0 g粉碎均匀的样品，放入15 mL顶空瓶中密封，采用动态顶空制样.GC-MS分析图谱经计算机和人工把每个峰同时与NIST library和Wiley Library相匹配检索定性，匹配度和纯度大于800(最大值1 000)作为定性分析结果.对化合物进行定量分析时，对总离子流量色谱图用峰面积归一化法定量，得出各组分的相对含量.

固相微萃取条件的为：固相微萃取头CAR/PDMS 75 μm(美国SUPELCO 公司)，萃取温度80 ℃，萃取时间40 min，解吸时间3 min.

仪器条件为：色谱柱为HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，分流比2∶1.升温程序为起始温度50 ℃，保持3 min，以每分钟5 ℃速率升至150 ℃，再以每分钟10 ℃速率升至260 ℃.离子源EI，电离能量70 EV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围20～450 amu.

1.3.2 统计分析.

用Origin 7.5作图，并用SPSS 18.0对数据进行统计分析.

2 实验结果及分析

2.1 加工进程中TN和NPN变化

风羊腿加工进程中TN和NPN变化见图1和图2.

图1 加工进程中TN含量变化曲线

图2 加工进程中NPN含量变化曲线

由图1和图2可知，羊腿肉TN初始含量为9.24%，腌制期结束时稍降低，在风干发酵进行中逐渐有所上升，风干发酵结束时未添加微生物发酵剂的A组TN值和NPN值分别为11.06%和0.24%，真空包装贮藏15 d后为11.57%和0.26%.风干发酵结束时添加微生物发酵剂的B组TN值和NPN值分别为11.06%和0.26%，真空包装贮藏15 d后为11.57%和0.24%.TN值在包装贮藏期有较显著提升，NPN值变化不大，视乎呈现后发酵现象.两组比较，添加发酵剂组变化幅度稍大，但两组差异不显著.

2.2 加工进程中游离氨基酸变化

风羊腿加工进程中游离氨基酸变化见表1和表2，总游离氨基酸变化见图3.表1、2中，RM为原料，AP为腌制后制品，FD为发酵风干时间(天)，PS为包装贮藏后成品.

图3 加工进程中总游离氨基酸变化曲线

结果显示，游离氨基酸量均随羊肉火腿加工进程有不同程度的增加.未添加微生物发酵剂的A组，原料肉中游离氨基酸总量为635.69 mg /100 g，产品中游离氨基酸总量为3 115.08 mg /100 g，增加了4.9倍.添加微生物发酵剂的B组原料肉中游离氨基酸总量为636.82 mg/100 g，产品中游离氨基酸总量为5 211.18 mg/100 g，增加了8.2倍.添加微生物发酵剂呈现极为显著的加速蛋白质分解，促进游离氨基酸的形成.

未添加微生物发酵剂的A组，游离氨基酸增加最多的是苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)，其次是精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)等，胱氨酸(Cys)则降低较多.添加微生物发酵剂的B组，游离氨基酸增加最多的是谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)，其次是异亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)等，胱氨酸(Cys)稍有下降.

表1 风羊腿(A组)游离氨基酸测定结果表/(mg/100 g)

表2 风羊腿(B组)游离氨基酸测定结果表/(mg/100 g)

2.3 产品挥发性风味成分分析

本研究采用GC-MS分析法对两组羊腿产品中挥发性风味物质进行测定，结果见图4和表3.

图4 风羊腿挥发性风味成分总离子流图

由图4和表3可知，就风味物相对含量上比较，A组含量最高的为醇类和酸类，其次分别为醛类、酮类、烯烃类和酚类，酯类物质未检出；B组含量最高的为醇类和醛类.而从生成的风味物种类分析，A组依次为：酸类(8种)>醇类(5种)>醛类(4种)>烯烃类(3种)=酚类(3种)>酮类(2种)>酯类(0种)；B组中依次为：醛类(13种)>醇类(8种)=酸类(8种)>酯类(5种)>酮类(3种)>烯烃类(2种)=酚类(2种).A组共检出25种，B组共检出41种，添加微生物发酵剂的B组显然更多，表明微生物发酵剂对风羊腿风味物质形成发挥了促进作用，这与Wang等[7-8]在微生物发酵剂对四川腊肠和腊肉风味影响的研究中的结果相符.

对产品中各类风味成分进行分类分析比较发现，醇类物质在未添加微生物发酵剂的A组中检测到5种，在添加微生物发酵剂的B组中检测到8种，两组中均检测到的物质为乙醇、正戊醇、沉香醇、α-松油醇和苯甲醇，添加了微生物发酵剂的B组产品α-松油醇和苯甲醇含量较A组有所提升，此外，1-己醇、2-辛烯-1-醇和正辛醇也比A组更加丰富；醛是肉香味的主要成分，未添加微生物发酵剂的A组产品中检测出了4种醛类化合物，其中主要为壬醛，添加微生物发醇剂的B组产品中检测出了13种醛类化合物，与未添加微生物发酵剂的A组相比，醛类化合物的种类和含量均得到提升， 说明微生物对提升醛类化合物含量具有较强的促进作用；酸类物质在两组产品中均检测出8种，主要为乙酸，但添加微生物发酵剂的B组乙酸含量与未添加微生物发酵剂的A组相比大大降低；酯类物质在未添加微生物发酵剂的A组中未检出，在添加微生物发酵剂的B组中检出5种，以辛酸乙酯和癸酸乙酯为主，具有果香和酒香香气，对风味有促进作用.对比可见，添加了微生物发酵剂的B组产品酸类物质有所降低，而酯类物质含量得到提升，烯烃类化合物及酚类化合物两组产品之间差异不大.

表3 风羊腿挥发性风味物质比较

3 结 论

本研究在四川风羊腿加工中，以传统工艺为基础，选择商业化直投式微生物发酵剂，进行了腌制、风干发酵、包装贮藏等制作工序，并对不同阶段产品TN、NPN、游离氨基酸和风味物含量进行了分析.结果显示：加工进程中TN和NPN在包装贮藏期有较显著提升，但添加与未添加发酵剂的产品差别不显著.游离氨基酸量均随羊肉火腿加工进程有不同程度的增加，未添加微生物发酵剂的产品增加了4.9倍，添加微生物发酵剂产品增加了8.2倍，添加微生物发酵剂呈现极为显著的加速蛋白质分解，促进游离氨基酸的形成；风味物种类和含量检测结果中，添加微生物发酵剂的产品，风羊腿的风味物种类达到41种，而未添加微生物发酵剂的产品仅为25种，尤其是在醇类、醛类及酯类物质的种类和含量上，添加微生物发酵剂的产品均更为丰富，其中，醇类物质增加了3种，醛类物质增加了9种，酯类物质检测出5种，而未添加发酵剂的产品未检出酯类物质.出现上述结果的影响成因和机制有待进一步深入探究.