饲料中添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺生长性能和免疫相关酶活性的影响

■李军涛 邱承浩 冼健安 陈惠琴 张秀霞 鲁耀鹏 郑佩华 王冬梅

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室，海南海口571101)

壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是甲壳素(chitin)脱乙酰基后得到的一种带正电荷的高分子碱性多糖，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D，也是迄今为止所发现的唯一一种碱性多糖。甲壳素广泛存在于低等动物尤其是节肢动物(如虾、蟹和昆虫)的外壳中，也存在于真菌、藻类细胞壁中，资源丰富。全世界每年蟹、虾等水产品加工后的甲壳废弃物有100多万吨，其中含有10%～30%的甲壳素[1]。如果能变废为宝，意义重大。近年来，国内外专家学者通过对鲤鱼(Cyprinus carpio)[2]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[3]、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)[4]、草 鱼(Ctenopharyngodon idellus)[5]、暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)[6]、三角鲂(Megalobrama terminalis)[7]、真鲷(Pagrosomus major)[8]、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)[9]、斑节对虾(Penaeus monodon)[10]等水产动物通过浸泡和口服壳聚糖的方法应用于试验中，研究发现在水产动物的养殖中添加适宜浓度的壳聚糖能够调节营养物质代谢、促生长及增强免疫性能等效果，可用于替代传统化学药物及抗生素的使用，推动水产养殖业的可持续发展。但壳聚糖在方斑东风螺的饲料添加方面的研究尚未见报道，本试验拟在方斑东风螺的配合饲料中添加不同梯度的壳聚糖，探究不同添加梯度下对方斑东风螺生长性能和免疫相关酶活性的影响。方斑东风螺人工饲料正处在研发推广的关键时期，以期能为高效人工配合饲料的研发奠定基础。

1 材料方法

1.1 试验饲料

基础饲料组成及营养水平见表1，配制饲料前先将饲料原料充分粉碎，过80目筛，其中不添加壳聚糖的基础饲料作为对照组，分别在基础饲料中添加0.2%、0.6%、1%壳聚糖作为3个试验组。按照配方比例，再加入30%的水分在V型混合机中混匀30 min。将配好的各组饲料分别储存在-20 ℃冰箱中备用。饲喂前解冻至室温，加入适当比例的水投喂。

表1 基础饲料组成及营养水平

1.2 饲养管理

该养殖试验是在海南省琼海市长坡镇青葛村的养殖场进行。选取体格健壮，活力良好，无病害的方斑东风螺稚螺480颗，随机分为4个组，每组3个重复，随机分到12个养殖试验箱中于室内养殖，养殖箱的规格为50 cm×40 cm×40 cm，每个箱中放入螺苗40 颗，逐一编号，记录各组初始总重。养殖箱中铺3～4 cm 厚的沙，养殖用海水经砂滤池过滤，试验采取24 h 流水养殖，驯养期一周左右，驯养期间投喂对照组饲料。试验期间各组饲喂各自对应的饲料，日饲喂量约为螺总重的5%左右，并根据实际摄食情况进行调整，饲料放置于玻璃培养皿中方便收集残饵、观察摄食情况及减少对养殖箱中沙子的污染，每天16：00 投喂，养殖周期为90 d。

1.3 样品采集与测定

养殖试验周期结束后，停食24 h。取样时将方斑东风螺冲洗干净后称重，进行液氮速冻，运回实验室后放入-80 ℃冰箱待测。从冰箱取出样品，待适当解冻后敲碎螺壳，取出螺肉和内脏，分离肝胰腺，用生理盐水清洗后测定计算生长指标，免疫酶活性检测。

1.4 生长性能计算公式

增重率(WG，%)=100×(终末螺均重-初始螺均重)/初始螺均重

肉壳比(meat shell rate)=螺肉的质量(g)/螺壳的质量(g)

脏体比(VSI，%)=100×内脏团重(g)/螺体重(g)

肥满度(CF)=肉重(g)/螺体重(g)

1.5 免疫功能测定

过氧化物酶(POD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、微量丙二醛(MDA)含量、溶菌酶(LZM)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性、碱性磷酸酶(AKP)活性，测定均采用购自南京建成生物试剂公司试剂盒，酶活性的测定方法按照试剂盒的说明书测定。

1.6 数据统计与分析

试验数据处理采用软件SPSS 22.0 对4 个组进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan's法多重比较，所得试验结果均采用“平均值±标准差”的形式表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺生长性能的影响(见表2)

表2 添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺生长性能的影响

由表2 可知，1%和0.6%壳聚糖添加组方斑东风螺稚螺的成活率分别达到了94.17%和92.5%，明显高于对照组，差异显著(P＜0.05)，0.2%壳聚糖添加组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，成活率为89.17%也高于对照组，表明添加壳聚糖可以提高方斑东风螺稚螺的成活率；各壳聚糖添加组与对照组相比在增重率、肥满度、肉壳比、脏体比都没有出现显著性差异(P＞0.05)。随着壳聚糖添加量的增加，方斑东风螺稚螺的增重率呈现逐渐加大的趋势，说明添加壳聚糖能够一定程度的提高对饵料的利用效率，加快生长速度。肥满度、肉壳比、脏体比的趋势是先增加后下降，均在0.6%壳聚糖添加组出现最大值，结果表明添加壳聚糖后方斑东风螺的可食用部分增加，螺体的比例得到一定程度的优化。

2.2 添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺免疫相关酶活性的影响(见图1～图5)

由图1可知，0.6%壳聚糖添加组方斑东风螺肝胰脏中的ACP 活性明显高于对照组和1%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)，其他组间没有出现显著差异；在0.2%和0.6%壳聚糖添加组方斑东风螺肝胰脏中AKP 的活性明显高于对照组和1%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)。方斑东风螺肝胰脏中ACP和AKP的活性随着壳聚糖添加量的增加都呈现出先增加后下降的趋势。

图1 肝胰脏中ACP和AKP活性

由图2可知，0.2%壳聚糖添加组的方斑东风螺肝胰脏中溶菌酶的活性明显高于对照组和0.6%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)，0.6%壳聚糖添加组明显低于1%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)，但与对照组差异不显著(P＞0.05)。

图2 肝胰脏中溶菌酶活性

图3 肝胰脏中POD活性

图4 肝胰脏中T-AOC活性

由图3可知，对照组方斑东风螺肝胰脏中的POD的活性明显高于0.2%和1%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)，达到46.8 U/mg prot.，其他组间没有出现显著差异；方斑东风螺肝胰脏中POD的活性随着壳聚糖添加量的增加呈现出下降趋势。

0.6%壳聚糖添加组方斑东风螺肝胰脏中T-AOC活性最高，达到11.78 U/mg prot.，如图4 所示，明显高于对照组、0.2%和1%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)，其他组间差异不显著(P＞0.05)，方斑东风螺肝胰脏中T-AOC的活性随着壳聚糖添加量的增加都呈现出先增加后下降的趋势。

图5 肝胰脏中MDA含量

0.2%壳聚糖添加组方斑东风螺肝胰脏中MDA含量最高，达到57.93 nmol/mg prot.，如图5 所示。0.2%和0.6%壳聚糖添加组的MDA含量明显高于对照组和1%壳聚糖添加组，差异显著(P＜0.05)。方斑东风螺肝胰脏中MDA含量随着壳聚糖添加量的增加呈现出下降的趋势。

3 讨论

3.1 添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺生长性能的影响

壳聚糖是一种应用较为广泛的免疫增强剂，主要通过：①吸附H+，结合体内酸性物质, 抑制、中和胃酸分泌，保护胃黏膜；②促进肠内有益菌群的繁殖，抑制有害菌群的滋生及减少大肠杆菌生长的机会，调整肠道生态环境，提高鱼体消化机能；③提高肠道和肝胰脏的蛋白酶、淀粉酶，以及肝脏极低密度脂蛋白的活性；④在饲料表面形成一层保护膜，延长水化时间，保护饲料养分，防止霉变不污染水源等途径提高生长性能和饲料利用率[11]。本试验研究发现在饲料中梯度添加壳聚糖方斑东风螺稚螺的成活率呈现持续增加的趋势，添加量为1%时成活率最高为94.17%，可能是由于壳聚糖作为免疫增强剂一方面抑制了病原菌在螺体的滋生，另一方面增强方斑东风螺自身的免疫性能，体质增强，成活率增加，该结果与添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺免疫性能的影响一致；添加0.6%的壳聚糖后方斑东风螺的肥满度、肉壳比和脏体比在对照组和各试验组中达到最大值，而当其添加量继续增加时，方斑东风螺的肥满度、肉壳比和脏体比反而有所下降。说明添加量为0.6%的壳聚糖可以提高方斑东风螺的肥育程度，可食用部分增加，而超过1%的添加量则对该几种指标无益。此结果与罗非鱼饲料最适壳聚糖添加量0.5%[12]、花鲈饲料最适添加量0.5%[13]一致，可能是因为壳聚糖具有很强的吸附离子和蛋白质的能力，过量添加时吸附了生长所必需的营养物质，而导致消化吸收能力的下降。

3.2 添加壳聚糖对方斑东风螺稚螺免疫性能的影响

壳聚糖可以提高白细胞吞噬率，提高补体活性[14]，提高杀菌力，增强免疫酶活性，增强呼吸爆发作用，促进抗体合成，可能的作用机制是调节免疫细胞中NO和PGE2二种生物活性物质的生成[15]，从而达到对非特异性免疫和特异性免疫都能产生作用。本研究发现，添加0.6%壳聚糖时方斑东风螺肝脏中的ACP和AKP活性达到最大，且与对照组差异显著(P＜0.05)，随着壳聚糖添加量的增加呈现先增加后下降的趋势，这与刘金海等[15]研究发现的在半滑舌鳎饲料中梯度添加(0、300、600、900、1 200、1 500、1 800 mg/kg)黄芪多糖得到的结果一致，另外在松浦镜鲤幼鱼(Cyprinus specularis)[16]饲料中添加维生素D3后酸性磷酸酶活性的变化，王维新等[17]在仿刺参(Apostichopus japonicus)24 h 体内碱性磷酸酶活性的变化得到结果类似的；添加0.2%壳聚糖后方斑东风螺肝胰脏中溶菌酶的活性明显高于对照组，差异显著(P＜0.05)，0.6%壳聚糖添加组方斑东风螺肝胰脏中T-AOC 活性最高，达到11.78 U/mg prot.。明显高于对照组差异显著(P＜0.05)，这与周永昌等[18]研究发现添加1.0 g/kg 的复方种草药可以提高雄体中华绒螯蟹幼蟹血清中T-SOD、T-AOC酶活性，降低肝胰脏中MDA的含量；凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）饲料中添加益生菌可以提高CAT(对 照 组43.22 U/ml，试 验 组76.33 U/ml)，TSOD(对照组60.61 U/ml，试验组101.18 U/ml)的活性[19]、罗氏沼虾饲料中添加党参、黄芪等中草药可以提高溶菌酶及酚氧化酶的活力[20]的结果类似。说明添加壳聚糖能够提高方斑东风螺的免疫相关酶的活性，但是不同的酶活性最大的添加梯度表现不一致，可能的原因是不同的免疫相关酶基因表达差异造成的，具体的原因有待进一步研究。从对方斑东风螺养殖成本和对生长性能、免疫相关酶活性的综合考虑，0.6%壳聚糖的添加量最适宜。