家蝇蛹的营养成分分析及抗氧化肽制备工艺研究

■孙婷婷 杨文哲 张思晨 赵志敏 何国瑞 杨得坡*

（1.中山大学药学院生药与天然药化实验室，广东广州510006；2.广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，广东广州510006；3.广东省现代中药工程技术研究开发中心，广东广州510006)

自由基是细胞正常代谢的一类产物，在体内具有双重作用，在中低浓度时，可诱导细胞分化、增殖和迁移；参与防御感染因子，属于先天免疫系统的重要部分；同时还是多种细胞信号通路的信号分子[1]。但当体内的氧化还原体系失去平衡，累积大量极不稳定的自由基时，它们又会损伤核酸、蛋白质、脂质以及各种细胞结构，从而诱发细胞凋亡，甚至坏死，严重时则引起各种疾病，包括癌症[2]、心血管疾病[3]、关节炎[4]、神经退行性疾病等年龄依赖性疾病[5-7]。研究表明，体内的氧化应激反应也与衰老存在着密切的联系[8-9]。近些年来，人们对这些慢性疾病的密切关注为抗氧化剂的应用提供了广大的平台。目前常用的抗氧化剂主要包括化学合成的抗氧化物质[如叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）等]和天然来源的抗氧化物质[如抗坏血酸（VC）、谷胱甘肽（GSH）以及一些酶类[10]]。由于化学合成的抗氧化剂存在潜在的急性毒性和发育毒性[11]，天然抗氧化剂的应用得以扩大。过去的二十年间，从可食用动植物中发现新的抗氧化肽成为研究的热点[12]，抗氧化肽具有低毒高效，容易吸收的特点，目前主要从水产品和可食用植物中得到，对昆虫资源的开发十分匮乏。

家蝇（Musca Domestica）是一种完全变态的资源型昆虫，分布广泛，常见于垃圾堆、粪池中，以腐烂的动物残骸、粪便、餐厨垃圾为食，具有强大的防御系统。因其生长周期短、繁殖能力强、幼虫的营养成分丰富，已被开发成饲料及饲料添加剂[13-14]。临床上使用家蝇幼虫进行清创治疗，可减少伤口的感染，促进伤口的愈合[15]。有研究发现，蝇蛆体内含有丰富的耐高温抗氧化多肽[16]，蝇蛆酶解多肽具有清除自由基的能力[17]，蝇蛆粉可以通过调节UCP4 和CyclinD1 信号通路，以及调制JNK和P38信号通路来防御阿尔兹海默症小鼠体内的氧化应激损伤[18]。但是目前对家蝇的研究主要集中在幼虫阶段，对蛹的研究几乎空白。蛹是家蝇变态发育过程中的重要阶段，对生存条件要求极低，含有十分丰富的生物质，且其蛋白质与幼虫阶段的蛋白质存在一定差异，是开发新的生物活性物质的一个重要来源。

研究以家蝇蛹为对象，分析其组成成分，并分别用水提醇沉法、热变性法和酶解法这三种方法制备得到家蝇蛹抗氧化肽，通过对比得率、多肽含量、分子量分布以及抗氧化活性，比较三种方法制备抗氧化肽的特点及优劣，为家蝇蛹的应用开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

家蝇蛹由广东盈亨生物科技有限公司提供，经中山大学药学院杨得坡教授鉴定为双翅目蝇科家蝇的蛹。

碱性蛋白酶（20 万U/g）购自北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、氯化亚铁（FeCl2）、菲洛嗪、邻苯二甲醛、还原型谷胱甘肽（标准品）、VC（标准品）购自上海麦克林生化科技有限公司；二硫苏糖醇（DTT）购自阿拉丁（上海）有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS 法）、总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP 法）、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、快速银染试剂盒购自碧云天生物技术公司；无水乙醇、硫酸亚铁（Fe-SO4）、水杨酸、四硼酸钠、乙二胺四乙酸二钠等分析纯试剂购自天津大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；低温高速离心机，德国HERMLE 公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；多功能酶标仪，德国BMG 公司；pH 计，上海三信仪表厂；旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；冷冻干燥机，德国Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

收集家蝇鲜蛹，洗净，低温处死后烘干，粉碎后过24 目筛，得到家蝇蛹粉。采用索氏抽提法，正己烷为溶剂对家蝇蛹粉进行脱脂，通风橱内挥干溶剂，得到家蝇脱脂蛹粉，保存于4 ℃待用。

1.3.2 家蝇蛹的成分分析

总蛋白质的含量用凯氏定氮法测定[19]；脂肪含量采用索氏抽提法测定[20]，正己烷作为提取溶剂；总糖含量采用硫酸-苯酚法测定[21]；灰分采用高温灼烧法测定[22]。

将得到的家蝇蛹粉提供给华南理工大学测试中心进行水解氨基酸测试。

1.3.3 水提醇沉法制备家蝇蛹抗氧化肽

根据王芙蓉等[23]的方法，准确称取家蝇脱脂蛹粉10 g，按料液比1∶20用双蒸水低温浸提30 min，于5 000 r/min 离心10 min，取上清液，重复浸提3 次，合并上清液，加入无水乙醇至终浓度为75%，在低温中静置2 h 以上，5 000 r/min 离心10 min，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩后在冷冻干燥机中干燥，得到家蝇蛹抗氧化肽，称重，计算得率。

1.3.4 热变性法制备家蝇蛹抗氧化肽

根据王土连等[16]的方法，准确称取家蝇脱脂蛹粉10 g，按料液比1∶20 加入双蒸水，在80 ℃中水浴处理30 min，于5 000 r/min离心10 min，取上清液，在冷冻干燥机中干燥，得到家蝇蛹抗氧化肽，称重，计算得率。

1.3.5 酶解法制备家蝇蛹抗氧化

参考郑荣等[24]的方法，并根据实际情况改进部分条件，准确称取家蝇脱脂蛹粉10 g，加入20倍量的双蒸水，混匀，在100 ℃中水浴10 min 使蛋白质变性，冷却至酶解的温度，调pH值至9.5，加入8 000 U/g的碱性蛋白酶（按底物质量计算），在55 ℃中恒温油浴1 h，迅速放入100 ℃水浴中灭活10 min，冷却至室温，于5 000 r/min 离心10 min，取上清液，在冷冻干燥机中干燥，得到家蝇蛹抗氧化肽，称重，计算得率。

1.3.6 OPA法检测多肽的含量

游离的胺基与邻苯二甲醛（OPA）反应可生成黄色络合物，在340 nm 处有特征吸收。本研究采用OPA 法检测样品中的多肽含量，OPA 试剂配制如下：准确称取1.905 g 硼砂，50 mg 十二烷基硫酸钠，溶于30 ml 双蒸水，配得溶液A；准确称取40 mg OPA，溶于1 ml 无水乙醇，转移至溶液A 中；准确称取44 mg 1,4-二巯基苏糖醇（DTT），加入溶液A 中溶解；最后用双蒸水定容至50 ml，配得OPA 试剂。

绘制标准曲线及样品检测：使用还原型谷胱甘肽标准品绘制标准曲线，配制系列浓度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/ml）的还原型谷胱甘肽标准溶液。将20 μl 样品溶液和150 μl 的OPA 试剂混匀，精确反应2 min，在340 nm 波长处检测吸光度，绘制浓度-吸光度标准曲线。将样品配制成1 mg/ml 的溶液，实验步骤同上，利用标准曲线公式计算多肽含量。

1.3.7 多肽的分子量分布

用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）-银染的方法检测多肽的分子量分布。考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白质含量，每个泳道上样20 μg，电泳完成后进行银染观察。

1.3.8 DPPH自由基清除能力

取50 μl 0.4 mmol/l DPPH的乙醇溶液和50 μl样品溶液加入96孔板，混匀后静置30 min，于519 nm测得吸光度。VC 和谷胱甘肽作为阳性对照。DPPH 自由基的清除率按照下式计算：

清除率（%）=[1-(A2-A1）/A0]×100

式中：A0——空白组，以蒸馏水代替待测溶液量(ml)；

A1——对照组，以无水乙醇代替DPPH溶液量(ml)；

A2——试验组，即加入待测溶液量(ml)。

1.3.9 ABTS自由基清除能力

根据试剂盒的方法，在96 孔板中加入200 μl ABTS 工作液和10 μl 待测溶液，混匀后室温孵育5 min，于740 nm 处检测吸光度。维生素C 和谷胱甘肽作为阳性对照。ABTS 自由基清除率按照下式计算：

清除率（%）=（1-A1/A0）×100

式中：A0——空白组，以蒸馏水代替待测溶液量(ml)；

A1——试验组，即加入待测溶液量(ml)。

1.3.10 羟基自由基清除能力

采用水杨酸-硫酸亚铁反应体系，将8 μl 18 mmol/l水杨酸、52 μl 样品溶液、8 μl 18 mmol/l FeSO4溶液混匀，加入32 μl 0.1% H2O2启动反应，静置30 min，于510 nm处检测吸光度。VC作为阳性对照。羟基自由基清除率按照下式计算：

清除率（%）=[1-(A2-A1）/A0]×100

式中：A0——空白组，以蒸馏水代替待测溶液量(ml)；

A1——对照组，以蒸馏水代替FeSO4溶液量(ml)；

A2——试验组，即加入待测溶液量(ml)。

1.3.11 FRAP法测试还原能力

标准曲线测定：配制系列浓度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/l）的标准物质FeSO4·7H2O，96 孔板的每个检测孔中加入180 μl FRAP 工作液、5 μl待测溶液，37 ℃孵育3～5 min，于539 nm 测定吸光值，绘制浓度-吸光度曲线。根据标准曲线计算样品的还原能力，表示为N mg/ml 样品的还原能力为X mmol/l FeSO4·7H2O。VC 和谷胱甘肽作为阳性对照。

1.3.12 亚铁离子螯合能力

亚铁离子能与菲洛嗪络合形成紫色络合物，在562 nm 处有特征吸收，本文采用亚铁离子-菲洛嗪体系检测抗氧化肽的亚铁螯合能力。将70 μl待测溶液、10 μl FeCl2溶液、20 μl 菲洛嗪溶液混合均匀，室温孵育10 min，于562 nm 测得吸光度。EDTA-2Na 作为阳性对照。亚铁离子螯合能力按照下式计算：

亚铁离子螯合能力（%）=[1-(A2-A1）/A0]×100

式中：A0——空白组，以蒸馏水代替待测溶液量(ml)；

A1——对照组，以蒸馏水代替FeCl2溶液量(ml)；

A2——试验组，即加入待测溶液量(ml)。

1.3.13 单因素试验优化酶解工艺

本文探索了酶解温度、时间和加酶量三个因素对产物抗氧化能力的影响。a. 酶解温度：在料液比为1∶20、pH 值9.5、时间30 min、加酶量8 000 U/g 的条件下，考察系列酶解温度（45、50、55、60、65 ℃）对产物的DPPH 自由基清除能力的影响；b. 酶解时间：在料液比为1∶20、pH 值9.5、温度55 ℃、加酶量8 000 U/g 的条件下，考察系列酶解时间（15、30、45、60、75 min）对产物的DPPH 自由基清除能力的影响；c. 加酶量：在料液比为1∶20、pH 值9.5、温度55 ℃、时间30 min的条件下，考察系列加酶量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g）对产物的DPPH 自由基清除能力的影响。

1.4 数据分析

所有试验均重复3次，取“平均值和标准偏差”作为最终结果，用GraghPad Prism 5.0软件处理数据。

2 结果

2.1 家蝇蛹的成分分析（见表1、表2）

表1 家蝇蛹的主要成分分析（n=3，%）

表2 家蝇蛹的氨基酸组成（g/100 g蛹粉）

如表1 所示，鸡蛋、牛乳、大豆、柞蚕蛹和秘鲁鱼粉均是目前市场上高蛋白质的食品或饲料，家蝇蛹的营养成分丰富，蛋白质含量为63.13%，高于鸡蛋、牛乳、大豆和柞蚕蛹，与秘鲁鱼粉的蛋白质含量相当。而脂肪含量低于鸡蛋、牛乳和柞蚕蛹，略高于大豆，具有开发成高蛋白质饲料添加剂的潜力。

家蝇蛹的氨基酸组成如表2，共检测了17种氨基酸，合计约54.6 g/100 g蛹粉，其中必需氨基酸占总氨基酸（EAA/TAA）的36.26%，说明家蝇蛹具有较好的营养价值。研究发现[25]，肽中疏水氨基酸、芳香族氨基酸以及酸性氨基酸的含量与抗氧化活性具有密切的联系。疏水氨基酸可与脂肪酸自由基结合，中断自由基链式反应；芳香族氨基酸是质子供体，通过共振平衡，使吲哚自由基和苯氧自由基保持稳定；酸性氨基酸侧链结构中的羧基残基会对一些金属离子（Fe2+、Cu+）具有钝化作用。本研究的结果显示，家蝇蛹中酸性氨基酸占总氨基酸的20.15%，疏水性氨基酸占总氨基酸的48.90%，芳香族氨基酸占总氨基酸的12.27%，这三类与抗氧化活性相关的氨基酸占总氨基酸的56.96%，表明家蝇蛹中极可能含有丰富的抗氧化肽段。

2.2 抗氧化肽的制备得率及多肽含量（见表3）

表3 三种方法制备抗氧化肽的产率及多肽含量对比(%)

表3的研究结果显示，酶解法制备抗氧化肽的得率最高，达到70.80%，是热变性法（25.11%）和水提醇沉法（18.35%）的两倍以上。根据图1 所示的标准曲线进行计算，采用还原型谷胱甘肽作为标准物质，检测计算得到多肽的浓度与吸光度之间的标准曲线，曲线的相关系数较高，根据标准曲线进行计算，酶解法得到的多肽类物质最高，占终产物的66.50%，水提醇沉法和热变性法的效率不及酶解法，分别提取到53.87%和43.33%的多肽。

图1 OPA法测多肽含量的标准曲线

2.3 抗氧化肽的分子量分布

三种方法制备的抗氧化肽的SDS-PAGE-银染结果如图2，酶解法制备的抗氧化肽主要集中在10 kD及以下；热变性法制备的抗氧化肽主要有三个分子段，包含分子量在60～70 kD的热稳定性蛋白、分子量在35～45 kD 的热稳定性蛋白质以及分子量在10 kD及以下的肽段。对比来看，酶解法可以将大分子量的蛋白质水解成较小的肽段，且肽类的含量丰富，热变性法制备的不仅含有多肽，还存在大量蛋白质，水提醇沉法能够将大分子的蛋白质除尽，但小分子量的肽段也会被部分除去。

图2 三种方法制备的抗氧化肽的分子量分布

2.4 抗氧化肽的活性研究

图3、图4、图5 为三种方法制备的抗氧化肽的自由基清除能力对比图，VC 或谷胱甘肽为阳性对照。由图可知，三种方法制备的抗氧化肽均具有DPPH自由基、ABTA自由基和羟基自由基清除能力，且都具有浓度依赖性。热变性法制备的抗氧化肽的自由基清除能力最强，在0.25 mg/ml的浓度下，DPPH自由基清除率就达到了82.5%，超过了同等浓度的谷胱甘肽；在2 mg/ml 的浓度下，羟基自由基清除率达到了100%。酶解法制备的抗氧化肽的自由基清除能力也较强，在0.625 mg/ml 的浓度下，DPPH 自由基清除率达到82.3%；当酶解物的浓度为4 mg/ml 时，羟基自由基清除率达到91.2%。相比之下，水提醇沉法制备的抗氧化肽活性最弱。三种方法制备的抗氧化肽的自由基清除能力的IC50值如下：①DPPH自由基清除能力的IC50：0.383（WAM）、0.108（TDM）、0.324 mg/ml（EHM）；②ABTS 自由基清除能力的IC50：1.924（WAM）、0.604（TDM）、0.971 mg/ml（EHM）；③羟基自由基清除能力的IC50：2.227（WAM）、0.704（TDM）、1.684 mg/ml（EHM）。

图3 三种方法制备的抗氧化肽的DPPH自由基清除能力

图4 三种方法制备的抗氧化肽的ABTS自由基清除能力

图5 三种方法制备的抗氧化肽的羟基自由基清除能力

图6是FRAP法检测三种方法制备的抗氧化肽的还原能力的结果，从图中的结果可知，三种方式制备的抗氧化肽的还原能力均大于谷胱甘肽，其中热沉淀法的活性最好，水提醇沉法和酶解法制备的抗氧化肽的还原能力相似。

图7 是三种方法制备的抗氧化肽的亚铁离子螯合能力结果，EDTA-2Na作为阳性对照。图中的结果显示，酶解法和热变性法制备抗氧化肽的亚铁离子螯合能力较强，水提醇沉法制备的抗氧化肽的活性较弱，但都具有浓度依赖性。其中，酶解法的活性最强，在浓度为3 mg/ml时，螯合能力就达到了95%以上，其次为热变性法，这两种方法制备的多肽在6 mg/ml 的浓度时，螯合能力都趋近于100%。三种方法制备的抗氧化肽的亚铁离子螯合能力的IC50值分别为：9.677（WAM）、0.994（TDM）、0.567 mg/ml（EHM）。

图6 FRAP法检测三种方法制备的抗氧化肽的还原能力

图7 三种方法制备的抗氧化肽的亚铁离子螯合能力

综合来看，热变性法和酶解法制备的多肽的抗氧化活性较好，而水提醇沉法的活性较弱，活性的高低可能与蛋白质空间结构的打开程度以及活性肽段的暴露程度有密切联系。但热变性法制备的产物中多肽含量不高，含有较多的热稳定性蛋白质，可能也贡献了部分抗氧化活性[16]。结合上面的试验结果，热变性法可制备得到热稳定性的抗氧化肽/蛋白质，酶解法制备的产物中多肽类物质含量丰富，抗氧化活性强，为发现家蝇蛹中新的抗氧化肽提供了技术手段支撑。

2.5 单因素试验优化酶解工艺

单因素试验的结果如图8 所示，图8(A)：温度对酶解物的活性影响较为明显，当温度从45 ℃上升至60 ℃时，酶解物的DPPH 自由基清除率逐渐上升，酶解温度为60 ℃时，清除率达到60.3%，当酶解温度继续上升时，酶解物的自由基清除能力呈现下降的趋势，可能与高温破坏了碱性蛋白酶的活性有关；图8(B)：当酶解时间为30 min 时，酶解物的自由基清除能力达到最大值，为59.4%，之后随着提取时间延长，活性呈缓慢降低趋势，可能是水解过度的原因；图8(C)：加酶量对酶解物的活性影响较弱，当加酶量为6 000 U/g 时，酶解物的活性最好，再增加加酶量，酶解物的自由基清除能力趋于稳定。

图8 单因素试验优化酶解工艺

综上所述，确定最佳的酶解条件为温度60 ℃、时间30 min、加酶量6 000 U/g，在此条件下，0.5 mg/ml的酶解物的DPPH自由基清除率为61.7%。

3 结论

本研究分析了家蝇蛹的基本成分，家蝇蛹含有丰富的蛋白质和脂质，且氨基酸成分中与抗氧化活性相关的芳香族氨基酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量较高，占总氨基酸成分的56.96%，为制备抗氧化肽提供了依据。随后，用水提醇沉法、热变性法和酶解法制备得到了家蝇蛹抗氧化肽，其中酶解法制备抗氧化肽的产率最高，达到70.80%，酶解物中的多肽含量最高，达到66.50%，且该方法制备的抗氧化肽主要集中在10 kD 及以下，不含大分子的蛋白质，所以该方法制备多肽的效率最高。对比三种方法制备的抗氧化肽的活性可知，热变性法制备的抗氧化肽（含有部分大分子的热稳定性蛋白质）清除自由基的能力和对Fe3+还原能力最强，而酶解法制备的抗氧化肽的亚铁离子螯合能力最强，说明以上两种方法均可作为筛选抗氧化活性物质的方案，结合家蝇蛹的氨基酸成分分析，也进一步论证了家蝇蛹中含有丰富的抗氧化活性的肽类物质。最后，本研究还进一步优化了酶解法的工艺条件，单因素结果显示，在温度60 ℃、时间30 min、加酶量6 000 U/g 的条件下，可以获得自由基清除能力最强的酶解物。至于家蝇蛹中或家蝇蛹的酶解物中发挥抗氧化活性的具体成分，还有待进一步的研究。