不同农药对单细胞动物—草履虫毒性的研究

周 琳，潘晓燕

(周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001)

目前中国农业生产中经常使用大量的有机磷农药[1]，对水中的动植物产生严重污染.当今国内学者主要研究集中在农药对鱼类等多细胞动物的毒性影响，而在原生动物草履虫研究方面数据还比较少.草履虫是最简单的原生动物代表[2]，在水中运动速度快，能和水中的物质紧密接触，对毒性的敏感度远高于多细胞动物，是研究河水中是否具有有毒物质的一种较为理想的实验材料.笔者经过探究不同浓度的养乐果、吡虫啉和高效氯氟氰菊酯对草履虫的急慢性毒性作用，探索不同浓度的3种农药对草履虫的生长和种群密度的影响，从而为进一步研究农药的安全、水质检测和生态环境的保护提供实验数据和事实依据[3].

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象

所用草履虫采集于周口川汇区的生活污水.

1.1.2 药品

40%的养乐果；10%吡虫啉；2.5%的高效氯氟氰菊酯.

1.1.3 实验器具

显微镜、解剖镜、LRH-250-CT光照恒温培养箱、移液枪、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、容量瓶.

1.2 方法

1.2.1 制备稻草液

稻草培养液是草履虫培养中最常用的培养液之一.稻草培养液的制备：新鲜稻草秆采集于周口公园附近，并剪成2 cm左右的小段，按照100 mL水中加入1 g稻草的比例进行配制，在烧杯中煮沸15 min[4].待稻草液颜色变成黄褐色后停止加热，用pH计调节pH值.在烧杯上面盖双层纱布，扎紧，放在实验室静置24 h.

1.2.2 草履虫的采集

草履虫喜欢生活在阳光充足，并含有腐草的水沟、池塘或生活污水中[5]，尤其喜欢生活在细菌丰富的水域中[6].本实验所采用的草履虫采集于周口市川汇区内的生活污水，时间在4月份左右，水温为20 ℃左右.采集后可对着光源用肉眼进行观察，如同针尖大小快速游动的就是草履虫.

1.2.3 草履虫的纯化

应用微量分离法[7].每次用移液枪取0.01 mL含草履虫的水体滴到载片上，经不断重复分离镜检，直到得到不含其他任何杂质的纯净草履虫.将得到的纯净草履虫加入稻草培养液中，在25 ℃的恒温光照培养箱内培养一周左右[8].

1.2.4 草履虫的数量统计

测量计数前，先将待测的培养液充分摇匀[9]，用移液枪取0.01 mL培养液采样并进行镜检计数，得到草履虫个数并计算其种群密度.

1.2.5 实验处理方法

用稻草培养液分别配制养乐果、吡虫啉、高效氯氟氰菊酯的稀释液，其中养乐果试剂配制浓度分别为0.05,0.08,0.10,0.15,0.20,0.50,0.80,1.00 mg/L，吡虫啉试剂配制浓度为25,50,80,100,120,150,200 mg/L，高效氯氟氰菊酯试剂配制浓度分别为0.20,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00,20.00 mg/L，每种试剂每个浓度设置3个平行组，并设置3组空白对照，空白对照组为不添加任何试剂的稻草培养液.在每个试管内均加入0.1 mL含有不同浓度药剂的稻草液，并放入10个生活状态良好的草履虫，然后放置在25 ℃的恒温光照培养箱中培养.急性毒性实验的培养时间为1 h，慢性毒性实验的培养时间为48 h.待1 h和48 h后对草履虫的存活个数计数，并记录.

1.2.6 数据分析方法

取毒性稻草培养液进行镜检，计数出0.1 mL培养液内草履虫的死亡个数，从而计算出草履虫1 h急性毒性的死亡率，并确定不同农药对草履虫的完全致死浓度含量以及最小致死浓度的含量.在48 h后，从每管待测液中取出草履虫进行镜检，计数出草履虫的存活个数.并计算出0.1 mL内的草履虫的种群密度(种群密度=待测物种的个数/待测体积)[10].

2 结果与分析

2.1 急性攻毒实验结果

2.1.1 养乐果的急性毒性实验结果

在25 ℃恒温光照培养下，1 h后计算每个试管内草履虫的死亡个数，结果如表1所示.

表1 养乐果对草履虫1 h的急性毒性实验结果

注：1,2,3为三个平行组，空白为稻草培养液

在空白对照中，草履虫的死亡率为0；当浓度为0.05 mg/L时，草履虫才开始死亡；而在浓度为1.00 mg/L时，草履虫全部死亡，死亡率高达100%.同时随着养乐果浓度的不断增长，草履虫的死亡个数也不断增加.分析数据可知养乐果对草履虫具有较强的急性毒性作用，同时也确定了养乐果的完全致死浓度为1.00 mg/L，最小致死浓度则为0.05 mg/L.

2.1.2 吡虫啉的急性毒性实验结果

在25 ℃恒温光照培养下，1 h后计数出每个试管内草履虫的死亡个数，结果如表2所示.在空白对照中，草履虫的死亡率为0；在浓度为25 mg/L时，草履虫开始出现死亡个体；而在浓度为200 mg/L时，草履虫已经全部死亡.同时伴随着吡虫啉浓度的升高，草履虫死亡的数量也不停的增加.这说明吡虫啉对草履虫具有一定的毒性，同时可得吡虫啉的完全致死浓度为200 mg/L，最小致死浓度则为25 mg/L.

表2 吡虫啉对草履虫1 h的急性毒性实验结果

注：1,2,3为三个平行组，空白为稻草培养液

2.1.3 高效氯氟氰菊酯急性毒性实验结果

在25 ℃恒温光照培养条件下，1 h后计算每个试管内草履虫的死亡个数，结果如表3所示.

表3 高效氯氟氰菊酯对草履虫1 h的急性毒性实验结果

注：1,2,3为三个平行组，空白为稻草培养液

在空白对照中，草履虫的死亡率为0；浓度是0.20 mg/L时，草履虫才刚开始出现死亡个体，并且随着高效氯氟氰菊酯浓度的升高，草履虫的死亡数量急剧上升；而当浓度为20.00 mg/L时，草履虫完全死亡.分析数据可得高效氯氟氰菊酯对草履虫的完全致死浓度是20.00 mg/L，而最小的致死浓度则为0.20 mg/L.

2.2 慢性急性攻毒实验结果

2.2.1 养乐果慢性毒性实验

25 ℃的恒温光照箱内培养48 h后，计算出每个试管内草履虫的存活个数以及空白对照组中的存活个数，结果如表4所示.在浓度为0.05 mg/L时，草履虫的存活个数达到峰值，种群密度高达686.66 个/mL；在0.05～0.80 mg/ L范围内，随着养乐果浓度的增加，草履虫的存活个数减少，种群密度不断下降；在浓度为1.00 mg/L时，草履虫全部死亡.与空白对照组进行对比，看出空白对照组中的草履虫种群密度明显低于浓度为0.05 mg/L的养乐果培养液，说明在一定浓度范围内的养乐果，对草履虫种群的繁殖具有一定的促进作用，而且浓度越低，促进作用越明显.

表4 养乐果对草履虫48 h的慢性毒性实验结果

注：1,2,3为三个平行组，空白为稻草培养液.

2.2.2 吡虫啉慢性毒性实验

25 ℃的恒温光照箱内培养48 h后，计算出不同浓度的吡虫啉中草履虫的存活个数以及空白对照组中草履虫的存活个数，结果如表5所示.当浓度为25 mg/L时，草履虫的存活个数达到峰值，种群密度最大为583.33 个/mL；在浓度25～150 mg/ L 的范围内，随着吡虫啉浓度的不断增加，草履虫的存活个数逐渐减少，种群密度不断降低；浓度达到200 mg/L时，草履虫全部死亡.与空白对照组进行对比，可以看出空白对照组中的草履虫种群密度为266.66个/mL，明显低于浓度为25 mg/L的吡虫啉培养液中草履虫的种群密度.由此说明在一定浓度范围内的吡虫啉，对草履虫种群的繁殖具有一定的促进作用，而且浓度越低，促进作用越明显.

表5 吡虫啉对草履虫48 h的慢性毒性实验结果

注：1,2,3为三个平行组，空白为稻草培养液.

2.2.3 高效氯氟氰菊酯的慢性毒性实验

25 ℃的恒温光照箱内培养48 h后，计算出每个试管中草履虫的存活个数，结果如表6所示.浓度为20.00 mg/L时，草履虫的存活个数最多，种群的密度最高达到383.33 个/mL;在0.20～20 mg/L 范围内，随着高效氯氟氰菊酯的浓度降低，草履虫的存活个数越来越少，当浓度为0.20 mg/L时，草履虫的存活个数达到最低值.与空白对照组进行对比，可看出在浓度为0.20～0.50 mg/L范围内的草履虫存活个数低于空白对照组中草履虫的存活个数.可见在一定浓度范围内，浓度较低的高效氯氟氰菊酯对草履虫的生长繁衍产生遏制作用，而相反高浓度则会加速种群的生长繁殖.

表6 高效氯氟氰菊酯对草履虫48 h的慢性毒性实验结果

注：1,2,3为三个平行组，空白为稻草培养液.

3 讨论

在养乐果、吡虫啉和高效氯氟氰菊酯对草履虫的1 h急性毒性实验中，养乐果浓度为0.05 mg/L时，草履虫开始出现死亡，浓度为1.00 mg/L时，草履虫全部死亡，说明养乐果对草履虫的完全致死浓度为1.00 mg/L；吡虫啉浓度为200 mg/L时草履虫完全死亡，浓度为25 mg/L时才出现死亡个体，说明吡虫啉的完全致死浓度为200 mg/L；而高效氯氟氰菊酯在浓度为0.20 mg/L时开始出现死亡现象，在浓度为20 mg/L出现全部死亡现象，说明高效氯氟氰菊酯对草履虫完全致死浓度为20 mg/L.上述分析数据表明三种农药的浓度与草履虫的死亡率成正比，即农药的浓度越高，草履虫的死亡率越大.通过对三种农药的实验数据进行比对，显示草履虫对养乐果的毒性敏感度高于高效氯氟氰菊酯和吡虫啉.

在养乐果、吡虫啉对草履虫48 h慢性毒性实验中，养乐果和吡虫啉在一定浓度范围内，草履虫的存活个数及种群密度与养乐果和吡虫啉的浓度成反比，即养乐果和吡虫啉的浓度越低，草履虫的存活个数越多，种群密度越大.说明在一定浓度范围内，吡虫啉和养乐果对草履虫的生长和种群的繁殖具有促进作用.这一现象与内分泌干扰物[11]效应相类似.

内分泌干扰物是指在环境中存在着干扰人类和动物内分泌系统功能并产生不利影响的物质.一般通过摄入、积累等途径进入动物体内，对生物体的生长、繁殖、代谢等功能具有严重危害[12].近年来国内外学者对内分泌干扰物对生物体的影响做了许多研究，但多以高等动物作为研究对象，而对单细胞动物的研究却较少.Chantana等[13]和 Padungtod等[14]都研究了内分泌干扰物对人体内分泌系统以及生殖系统造成的影响.同时胡好远等[15]探究得出镉对单细胞草履虫种群密度的增长具有促进作用，因此猜测这种影响的产生是因为镉具有内分泌干扰物效应.但是对于养乐果和吡虫啉是否也具有内分泌干扰物的作用还有待进一步研究.

本实验中，高效氯氟氰菊酯对草履虫的48 h慢性毒性实验结果与养乐果和吡虫啉的实验结果具有明显区别.实验数据显示: 在浓度为0.20～20.00 mg/L 范围内，高效氯氟氰菊酯的浓度越高，草履虫的存活数量越多，种群密度越高，即在一定浓度范围内出现草履虫的种群密度随浓度的增大而增大的现象.这种现象与环境雌激素效应[16-17]相类似.外国学者Snell[18]和Radix等[19]首次研究证明，当水体具有雌激素活性的污染物后，会影响轮虫的生长繁衍.王莉霞等[20]探究了氰戊菊酯在单细胞动物中的影响，得出氰戊菊酯可能具有一定的雌激素效应.但高效氯氟氰菊酯是否也具有环境雌激素效应还有待更深入的探讨.