人DMP1结构及功能的生物信息学分析

黄燕 裴晋红 李钰娜 栗学清 武翠玲 郑军 王博 宋丽华

1.长治医学院基础医学部生物化学教研室，山西 长治 046000 2.长治医学院药学系，山西 长治 046000

牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)于1993年George在牙齿中首次发现而得名[1]，后期发现骨组织中，DMP1的表达水平显著高于牙本质[2]。DMP1在调节骨、牙齿矿化，体内磷水平稳态方面具有重要作用[3-4]。离体实验显示，DMP1作为转录因子或胞外整合素配体，通过激活MAPK信号转导途径，调控成骨细胞及成牙本质细胞分化[5]。近来，多项研究表明，一部分DMP1进入了细胞核，但其在核内的调控机制仍需探讨[6]。本文通过生物信息学方法分析DMP1的结构和功能，为深入研究该蛋白的功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

从NCBI的Gen-Bank数据库获得DMP1蛋白的 513个氨基酸的序列信息，进行后续的生物信息学分析。

1.2 方法

登陆在线软件，输入DMP1氨基酸序列，通过各参数分析并预测DMP1蛋白的性质、结构与功能。如：登陆Expert Protein Analysis System数据库，采用其中的Prot Param Tool工具分析DMP1的理化性质；Prort Scale Tool工具分析DMP1的亲疏水性质；SPORTII分析DMP1的亚细胞定位；Signal P 4.0软件分析DMP1信号肽，NLStradamus工具预测该蛋白的核定位信号；TMHMM 2.0分析DMP1的跨膜区域；SOPMA工具分析DMP1的二级结构，SWISS-MODEL预测蛋白的三级结构；Net Phos 3.1在线预测DMP1蛋白磷酸化位点；Net Nglyc 1.0 Server 在线预测DMP1蛋白N-糖基化位点；通过STRING数据库，构建DMP1的蛋白质间相互作用网络图；JASPAR预测可能的转录因子结合位点；Bio GPS数据库分析DMP1在人体正常组织中的表达情况；通过NCBI BLAST在线选择比对序列并构建系统进化树。

2 结果

2.1 Dmp1基因的编码产物分析

人Dmp1基因定位于4q22.1，包括7个外显子，有4中不同剪切方式，编码产物见表1，其中转录产物NM_004407.3全长2 693 bp，其相应的编码产物NP_004398.1为513个氨基酸组成的DMP1的共识序列。

表1 Dmp1 基因可变剪切产物Table 1 Alternative transcripts of Dmp1 gene

2.2 DMP1的理化性质分析

登陆ExPASy网站，采用Prot Param工具分析获得DMP1蛋白分子式为C2232H3458N674O987S8，相对分子量是55782.41 Da，丝氨酸含量最高，占到整个序列的21.4%。多处存在磷酸化及O-糖基化修饰位点。DMP1的半衰期为30 h，不稳定系数为86.69，归类为不稳定蛋白。DMP1序列中的酸性氨基酸-Asp和Glu共142个，碱性氨基酸-Arg、Lys及His共51个，理论上的等电点为4.00，表明DMP1是一种酸性蛋白质。

Prot Param 分析得到，DMP1的脂肪系数为33.47，平均亲水性是-1.598；登陆ExPASy网站，采用Prort Scale软件分析，DMP1最强亲水位点在第104位的天冬氨酸，分值-3.544，第7位的亮氨酸疏水性最强，分值2.600。纵观DMP1序列中所有氨基酸的亲疏水性质，如图1所示，亲水多于疏水，表明DMP1是亲水性蛋白质。

图1 DMP1 蛋白的亲-疏水性分析Fig.1 Hydrophilic-hydrophobic analysis of DMP1 protein

2.3 DMP1蛋白的亚细胞结构定位分析

通过SPORTⅡ预测，DMP1蛋白定位于细胞外、细胞质、细胞核的可能性分别为55.6%、22.2%和22.2%。

图2 DMP1蛋白信号肽分析Fig.2 Signal peptide analysis of DMP1

2.4 DMP1蛋白的信号肽、核定位信号及跨膜区分析

利用Signal P 4.1在线分析DMP1蛋白的信号肽序列，如图2所示。原始剪切位点C值最大切割点在第17个氨基酸残基位置，分值0.810；Y值即被结合的剪切点最高点在第17位氨基酸，分值为0.880；第10个氨基酸处为信号肽分值最高位点，分值0.972；1～16位氨基酸平均信号肽分值为0.918，能够形成经典的信号肽区域。运用NLStradamus工具预测蛋白的核定位信号，结果显示不存在核定位信号序列，见图3。TMHMM Server v.2.0在线预测，DMP1蛋白序列中无跨膜区，见图4。

图3 DMP1核定位信号分析Fig.3 NLS analysis of DMP1

图4 DMP1跨膜区域分析Fig.4 Analysis of transmembrane region of DMP1

2.5 DMP1蛋白的空间结构预测

SOPMA预测DMP1的二级结构，结果显示多肽链中α-螺旋占15.79%，无规卷曲占76.41%，延伸链占5.07%，β-转角占2.73%，其中无规卷曲占主导(图5)；SWISS-MODEL在线预测DMP1蛋白的三级结构，如图6所示。

图5 DMP1的二级结构分析Fig.5 Secondary structure prediction of DMP1

图7 DMP1蛋白磷酸化位点预测Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of DMP1 protein

图6 DMP1的三级结构预测Fig.6 Prediction of tertiary structure of DMP1 protein

2.6 DMP1蛋白磷酸化位点预测

NetPhos 3.1在线预测DMP1蛋白磷酸化位点，见图7。结果表明，DMP1含有123个潜在的磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点最多，有106个；苏氨酸磷酸化位点12个；酪氨酸磷酸化位点5个。除酪氨酸外的118个潜在磷酸化位点也是O-糖基化位点。

2.7 DMP1蛋白N-糖基化位点预测分析

NetNglyc 1.0 Server 在线软件预测DMP1蛋白N-糖基化位点，见图8，结果显示， DMP1蛋白序列中存在8个潜在N-糖基化位点。

图8 DMP1蛋白N-糖基化位点预测Fig.8 Prediction of N-glycosylation sites of DMP1

2.8 蛋白质相互作用、Dmp1基因5’非翻译区分析

STRING数据库预测与DMP1相互作用的蛋白，构建蛋白相互作用网络图，见图9，包括整合素α-V(ITGAV)、E1A 结合蛋白p300(EP300)、整合素β3(ITGB3)、Jun B原癌基因(JUNB)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)、外源核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPP1)、整合素结合的唾液酸蛋白(IBSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、X连锁的磷酸调节内肽酶同系物(PHEX)、TAF2 RNA聚合酶II (TAF2)，DMP1蛋白与这10种蛋白的相关系数分别为0.905、0.903、0.901、0.900、0.838、0.762、0.732、0.727、0.687、0.628，JASPAR分析显示JUNB作为转录因子可能结合Dmp1基因5’非翻译区(表2)调控DMP1的表达。此外，Myc、Eip74EF、SP1、Bcl6、Myb等转录因子都具有潜在结合位点，进一步提示DMP1的表达受到多种因素的影响。

表2 转录因子JUNB的DNA潜在结合位点Table 2 DNA Binding sites of transciption factor JUNB

图9 DMP1蛋白相互作用网络Fig.9 Protein-protein interaction network for DMP1

2.9 DMP1在人体正常组织中的表达

BioGPS数据库显示，DMP1蛋白在人体各正常组织均有表达，其中在心肌和骨骼肌中含量较高，如图10所示。提示DMP1具有重要的生物学功能，但目前对其功能还缺乏进一步了解。

图10 DMP1在人体各组织中的表达Fig.10 Expression of DMP1 in different human tissues

2.10 DMP1的系统进化分析

通过NCBI中BLAST分析，选择奇蹄目、食肉目、啮齿目、灵长目及偶蹄目动物序列直接建树，见图11。结果与物种进化程度一致，人DMP1蛋白在灵长类动物中具有保守的分子功能。

图11 DMP1蛋白分子进化树Fig.11 The phylogenetic tree of human DMP1 protein

3 讨论

DMP1属于小整合素结合配体N-糖蛋白家族成员，不仅表达于牙齿和骨组织，脑、心肌、肝脏等非矿化组织也有表达[7]。DMP1不仅可以诱导未分化的间充质干细胞分化为成骨细胞[8-9]，还可以通过调节FGF23来平衡体内磷酸盐代谢[10]；在成骨细胞分化的早期阶段，c-Jun调控Dmp1基因的转录，但在成骨细胞分化末期，c-Jun的作用并不显著。有研究显示，矿化过程中，c-Jun与调节蛋白p300相互作用，结合在启动子区，协同调节Dmp1基因的表达[11]；过表达Runx2能诱导C3H10T1/2细胞中Dmp1基因的表达[12]；lncRNA32865作用于Dmp1基因启动子区调控Dmp1的基因表达[13]；DMP1在Hacat细胞和口腔鳞癌细胞中的表达存在差异[14]；卵巢去势骨质疏松大鼠下颌骨中Dmp1 mRNA表达水平明显下降[15]；DMP1参与大鼠下颌前移过程中髁突软骨的适应性重塑，促进髁突软骨内成骨和软骨增殖[16]。以上研究表明，DMP1在骨代谢、肾的矿物质代谢、肿瘤的发生等方面均有影响，但其作用的分子机制尚未完全明了。

本研究基于生物信息学分析和预测DMP1的结构与功能，结果提示，人DMP1蛋白是酸性亲水蛋白，有信号肽，无跨膜区；主要二级结构元件是无规卷曲；具备丰富的磷酸化位点及糖基化位点；具有利于蛋白间相互作用的结构特点及多种转录因子潜在结合位点，人体各组织均有表达。

综上所述，提示DMP1多数为游离存在的酸性分泌性蛋白；无规卷曲占主导的二级结构元件表明DMP1具有疏松的结构特征，为与其他分子的相互作用提供了便利；多种修饰位点的存在为其功能活性的改变提供了更多可能；在人体各组织的广泛性表达，为其发挥重要的生物学功能提供了物质基础。因此，本文分析和预测DMP1的结构和功能，对明确DMP1作用的分子机制具有参考意义。