骨疏康颗粒对去卵巢小鼠体重、血清骨代谢指标和组织形态学的影响

杨骏杰 赵永见 王强 张岩 李晨光 施杞 王拥军,4 舒冰 赵东峰*

1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032 2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理论与治法重点实验室，上海 200032 4.上海中医药大学康复医学院，上海 201210

绝经后骨质疏松症(POP)是原发性骨质疏松症最常见的类型，患者以骨量降低、骨组织结构损坏、骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。随着人口老龄化日趋严重，POP发病率呈明显的上升趋势，给患者、家庭和社会带来沉重负担[2]。雌激素缺乏导致骨吸收增强是POP的重要病理改变，因此，降低骨吸收和增加骨生成，恢复骨吸收和骨生成的平衡成为治疗POP的重要策略。目前临床针对POP的治疗方案主要体现两个方面：①通过刺激成骨细胞分化促进骨生成。②通过抑制破骨细胞的骨吸收[3]。但是，目前临床上现存治疗POP的药物效果存在诸多不足[4]。因此，寻找安全有效、便于长期服用的药物是医务工作者面临的重要挑战。

中医药多遵从“肾主骨”理论指导治疗POP，补肾益精法是临床治疗POP重要法则之一，骨疏康颗粒(GSK)是其中具有代表性的方剂。GSK是在中医“补肾、益气、壮骨”等理论指导下构建的方剂，前期临床效果显著，成为中医药治疗POP的代表方剂。随后研究表明GSK能够抑制骨量丢失[5]，发挥系统调控骨生成和骨吸收的骨保护作用。同时，GSK能够显著提高血液中维生素D和钙的代谢水平[6]，从而增强骨生成。但是GSK在血液中对骨代谢指标的明确药理学作用尚未阐述。本研究以OVX小鼠为研究对象，阐述GSK治疗POP的药理学代谢作用。

1 材料和方法

1.1 材料准备

骨疏康颗粒(GSK)，国药准字号：Z20003255，辽宁康辰药业有限公司，主要成分：淫羊藿、熟地黄、骨碎补(补肾药物)、黄芪(益气)、丹参(活血)、木耳、黄瓜子等，遵循中药补肾、益气、活血等原理组方而成。按Meeh-Rubner氏公式[7]计算人体表面积为1.8 m2，小鼠体表面积为0.0 067 m2。按人的剂量为20 g骨疏康颗粒/70(kg·d)计算，小鼠的等效剂量约为4 g/(kg·d)。GSK溶于生理盐水，按照每次0.5 mL每只的剂量灌胃，每天一次连续干预3个月。

钙尔奇作为阳性对照药使用。钙尔奇D碳酸钙D3片(600 mg+D3 125IU，片剂)，国药准字H10950029，惠氏制药有限公司。本实验中按照临床剂量进行转换，钙尔奇D600。按人的剂量为2片/70(kg·d)计算，小鼠的等效剂量为0.372片/(kg·d)。每只小鼠平均体重30 g。将每片钙尔奇D溶于44.8 mL生理盐水，浓度0.2 232 g/mL，每只每次按0.5 mL剂量灌胃，每天一次连续干预3个月。

1.2 动物造模和干预

3月龄雌性C57BL/6小鼠120只，来自SLAC实验动物公司，饲养于上海中医药大学动物实验中心。随机分组(20只/组)为：正常组(假手术组，Con)、模型组(OVX)、钙尔奇对照阻(CA)、GSK低剂量组[GSKL：2 g/(kg·d)]、GSK中剂量组[GSKM：4 g/(kg·d)]和GSK高剂量组[GSKH：8 g/(kg·d)]。动物造模时，采用氯胺酮麻醉，从背部施行双侧卵巢切除术，假手术组仅从背部暴露腹腔，将卵巢暴露，剪去适量脂肪后复位缝合。保温条件下确保每组至少有16只小鼠存活。术后给予不同剂量GSK灌胃3个月。其中，钙尔奇对照组[0.223 g/(kg·d)]，正常组和模型组给予等量生理盐水。实验结束后，采集标本进行组织学分析。上述实验方案均经上海中医药大学动物保护与使用机构委员会批准(项目批准号：SZY201603007)。

1.3 检测指标

1.3.1小鼠体重变化情况：小鼠体重能够从整体水平反映小鼠的健康状态，也是评价药物治疗POP疗效和安全性的常用数据之一，本研究分别在治疗期间的1、2和3个月称量各组小鼠的体重变化情况。

1.3.2血清骨代谢指标：小鼠采用眼球取血方法获得全血，离心后获得血清。血清浓缩后按照等比例进行稀释。从SUSABIO 生物公司购买的ELSA 试剂盒，分别检测小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP、OCN表达水平。按试剂盒标准操作步骤，加入血清后37 ℃震荡30 min，然后酶标仪于562 nm检测各组小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP和OCN的表达，并进行统计分析。

1.3.3骨组织形态学：小鼠处死后取L5椎体，放入10%福尔马林过夜，然后流水冲洗2 h，加入4% EDTA脱钙液进行脱钙3周。然后用石蜡包埋和切片(5 μm)。样本切片后，常规脱蜡至水，盐酸乙醇分化30 s，之后放入Amresco公司的阿尔新蓝染色剂(货号0298)30 min，再次盐酸乙醇分化5 s后放入Acridine Orange 染色液中15 min，然后封片固定和干燥。分别观察正常组(Con)、模型组(OVX)、钙尔奇组(CA)以及GSK的低(GSKL)、中(GSKM)、高(GSKM)3个剂量组小鼠腰椎的骨组织形态。

1.4 统计学处理

实验验数据采用SPSS 20.0软件系统进行统计。结果满足正态分布、方差性检验，组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Dunnett检验比较GSK各剂量组、CA组与OVX组差异。上述统计结果，P< 0.05认为差异有统计意义。

2 结果

2.1 GSK对小鼠体重的影响

实验各组分别在小鼠造模成功后1周内开始灌胃小鼠(0 m)，并测量小鼠的体重。为检测GSK对小鼠体重影响，我们分别在干预1、2、3个月内，称量各组小鼠的体重变化。结果显示OVX组小鼠体重出现的增加(P<0.05),这与前面研究的发现吻合，其原因可能是去除卵巢后导致小鼠基础代谢率下降，因此对小鼠体重有刺激作用[8]。同时，在GSK干预的1、2和3月内，GSK干预各组小鼠之间的体重与OVX组体重有所下降，统计结果显示只有中剂量组(GSKM)观察到统计意义(P<0.05)，低剂量组和高剂量组未观察到统计意义(P>0.05)。

表1 GSK对小鼠体重的影响Table 1 Effect of GSK granule on the body weight of mice

注：0 m 造模成功后1周内的体重；1 m GSK灌胃1个月各组小鼠体重的变化；2 m GSK灌胃2个月各组小鼠体重的变化；3 m GSK灌胃3个月各组小鼠体重的变化。与正常组比较，*P< 0.05，与模型组比较，#P< 0.05。

2.2 血清骨代谢指标

采集外周血液后，检测各组小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP、OCN等骨生成指标的表达水平(图1)。研究结果发现OVX组3月时小鼠血清中骨生成指标与对照组相比，ALP(图2 A)和OCN(图2B)的表达有显著升高(P< 0.05)，而PINP(图2C)的表达下降(P< 0.05)。GSK干预后，骨生成指标PINP下降趋势减缓，而ALP和OCN的表达继续维持在较高水平。骨吸收指标方面，OVX组3月时骨吸收的β-CTX(图2D)指标升高(P< 0.05)，GSK干预后，β-CTX表达下降。血清学的研究表明GSK干预能够在总体水平上刺激骨生成相关指标PINP、ALP、OCN的表达，同时降低骨吸收指标β-CTX的表达，从而发挥系统调控骨生成和骨吸收的作用。

图1 GSK对小鼠血清中骨代谢ALP、OCN、PINP和β-CTX的影响(A)GSK刺激小鼠血清中ALP的表达。(B)GSK刺激小鼠血清中OCN的表达。(C)GSK刺激小鼠血清中PINP的表达。(D) GSK降低小鼠血清中β-CTX的表达。与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05。Fig.1 Effect of GSK granule on the serum expression of bone metabolic parameters ALP, OCN, PINP, and β-CTX

2.3 骨组织形态学检测

小鼠腰椎取材后，采用阿尔新蓝染色观察GSK对小鼠骨结构的作用。研究结果发现，去卵巢3月后，小鼠出现骨量丢失的表型，具体体现在小鼠腰椎的骨小梁数目较少、结构疏松、间隙变大(图2)。GSK干预后，小鼠骨量丢失得到缓解。上述研究表明，GSK干预后OVX小鼠骨量丢失的表型得到缓解，从而发挥了延缓去卵巢诱导的骨丢失的疗效。

图2 GSK对小鼠腰椎骨结构变化Fig.2 Effect of GSK granule on bone structure in the lumber vertebrae

3 讨论

本研究通过测量动物体重、血清骨代谢指标和组织形态等手段，证明GSK干预OVX小鼠模型骨量丢失的保护作用。同时在血液代谢水平能够降低骨吸收过程中β-CTX 的表达，同时刺激骨生成相关指标PINP、ALP、OCN的表达。并在组织学加以验证。综上所述，本研究提示GSK的两方面作用：一方面，能刺激成骨细胞的骨生成，提高PINP、ALP、OCN的表达水平。另一方面，抑制破骨细胞的骨吸收，降低β-CTX的表达。因此，本研究部分阐述了GSK发挥治疗POP的药物学作用，也为后期机制研究奠定基础。

OVX模型是目前较为公认的POP动物模型[9]，常用于POP治疗和预防的药物开发的药理、药效等实验。早在20世纪40年代Albright就提出POP的病理改变[10]：发现雌激素水平下降与POP的发病有密切的相关性。随后，研究发现雌激素可直接作用于成骨细胞和破骨细胞的雌激素受体，限制骨代谢中的骨转换[11]，延缓骨量丢失发挥骨保护作用。目前治疗POP的方法是一方面通过刺激成骨细胞分化促进骨生成，另外一个方面是抑制破骨细胞的骨吸收。但是目前临床常用的药物虽取得一定疗效，但是存在诸多不良反应。中医药已被证实是一种有效治疗POP替代药物，其优势是能够同时增加骨生成和抑制骨吸收，从而延缓骨量丢失，改善POP患者的骨质疏松病变[12]。随着现代医学的发展，利用中医药治疗骨质疏松症，着重调整机体整体功能，已成为一种趋势。

POP属于现代医学的病名，该病在历代中医文献中未见有明确的记载，但是根据其症状应该属于中医“腰痛”、“骨枯”、“骨燒”、“骨痿”、“虚劳”等疾病的范畴。POP发病的症状与“骨痿”病因、病机最为相似。其病因病机主要有肾精亏虚、脾胃虚弱、肝失调达、瘀血阻络等[13-14]。其中肾精亏虚是最为核心的病理基础，补肾益精法是治疗POP的一个重要法则。前期研究发现GSK治疗POP的作用原理是补肾益气、活血达到壮骨的目的[15]。其组成淫羊藿、熟地黄、骨碎补能益精填髓、补益肝肾，是为君药；黄芪、丹参益气活血，辅助配合补肾药物的补益作用，是臣药；木耳、黄瓜子补肾益气，活血壮骨，为佐使之药。因此，上述诸药配合主要治疗肾虚、气血不足所致包括POP在内的中老年骨质疏松症，适用于伴有腰脊酸痛、足膝酸软、神疲乏力等肾虚症状的患者。

本研究从小鼠体重检测结果可见，GSK干预的1、2、3月内OVX小鼠体重的出现下降，提示GSK干预后对OVX小鼠体重有所降低，从而佐证本实验设计的药物剂量未造成明显的毒性，药物的剂量选择是在安全剂量的范围内。血清骨代谢指标检测发现 GSK干预3月内能够增加去卵巢血清中ALP、OCN和PINP的表达，增加成骨细胞的活性。ALP、OCN是参与成骨细胞分化的的重要调控因子，他们与PINP都是反映成骨细胞骨生成的主要指标[16]。同时，补钙是临床治疗POP的常见基础方法，因此，本课题使用钙尔奇(CA)作为POP的基础用药和平行对照药物，证明GSK的疗效的确切性。但是，本课题目的是明确GSK的治疗效果，钙尔奇仅作为阳性参照，虽然钙尔奇与OVX组相比，也能提高血清中ALP、OCN和PINP的表达，但是其仅仅是作为阳性对照，而未涉及GSK与钙尔奇疗效的比较作用，未来研究可能涉及此作用。另外，GSK在调控破骨细胞分化方面的表现在能抑制OVX小鼠破骨活性指标β-CTX的高表达，从而抑制骨吸收。β-CTX是破骨细胞骨吸收溶解Ⅰ型胶原的进一步分解产物，通过检测血清β-CTX的水平对于早期诊断POP，评估骨量减少程度具有重要意义[17]。上述血清学作用通过骨组织形态学检测得以证明：GSK的低、中、高剂量干预能够延缓OVX造成的骨量丢失，其机制与其刺激骨生成和抑制骨吸收的作用相关。

综上所述，本实验通OVX小鼠体重、血清骨代谢指标和组织形态的研究证明GSK颗粒能刺激成骨细胞的骨生成和抑制破骨细胞的骨吸收，发挥系统调控的作用。该研究为后续治疗POP相关药物的开发奠定了一定的研究基础，同时也拓宽了临床治疗POP药物选择的范围。