高压氧联合神经生长因子局部注射对骨质疏松性骨折延迟愈合患者血清黏附因子及微循环指标表达的影响

白登彦 张文贤

1.甘肃省第二人民医院骨科，甘肃 兰州 730000 2.甘肃省中医院创伤骨科，甘肃 兰州 730050

骨质疏松症是由多种原因导致的骨量减少和骨质退变，增加骨脆性，载荷承受力和力学强度下降，从而容易发生细微甚至完全骨折[1]。近年来，由于其极高的发病率、致残率，骨质疏松症越加受到医学界关注。目前部分骨质疏松性骨折患者因治疗技术问题以及骨折类型及严重程度的影响，出现骨折延迟愈合等严重并发症[2]。部分患者在达到骨折正常愈合所需的时间后，骨折部仍未达到骨折完全愈合的标准[3]。骨折延迟愈合使患者康复时间延长，还有可能出现不愈合或者畸形愈合，增加再次手术风险，严重影响患者生活质量。研究[4]表明，神经生长因子能够促进骨折愈合，且颅脑损伤合并骨折患者，骨折愈合时间显著比单纯骨折患者愈合时间短。OPG/RANKL蛋白系统是由骨保护素 (osteoprotegerin，OPG) 和核因子Kappa B受体活化因子配体 (receptor of activator of nuclear factor B ligand，RANKL) 构成，是机体破骨细胞形成、分化和吸收调节的关键系统，对骨质疏松性骨折愈合有重要作用。高压氧疗法是指将患者置于高压氧仓中，并使患者呼吸高浓度氧气，以纠正组织缺血缺氧[5]。有研究[6]表明，高压氧疗法具有促进骨折愈合的作用，但是目前关于神经生长因子以及高压氧疗法对骨折延迟愈合患者的影响的报道较少。本研究就高压氧联合神经生长因子局部注射对骨质疏松性骨折延迟愈合患者血清黏附因子及微循环指标表达的影响进行报道，旨在指导临床。

1 材料和方法

1.1 一般资料

研究对象选取我院2016年11月至2017年11月间收治的骨质疏松性骨折且有延迟愈合患者84例，纳入标准[7]：①所有患者均符合骨质疏松性骨折诊疗指南(2017版)中关于骨质疏松性骨折的诊断标准；②康复时间已超过同类骨折的愈合时间但仍未愈合；③同类骨折愈合时间时复查 X 线片仍能够观察到骨折线；④骨折端存在少量骨痂且无骨端硬化；⑤均自愿参加并签署知情同意书。排除标准：①骨折康复时间不足4月；②骨折处感染严重；③病理性骨折；④妊娠期或哺乳期妇女；⑤严重系统疾病患者。采用随机数字法将其分为对照组和观察组，每组各42例。其中对照组患者年龄50～75岁，平均年龄(56.2±5.9)岁；男22例，女20例；平均病程(10.9±4.9)月。观察组年龄51～76岁，平均年龄(55.2±5.6)岁；男21例，女21例；平均病程(10.4±5.1)月。两组患者性别、年龄、平均病程等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。该研究已征得医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

①两组患者均行复位、固定和功能锻炼、营养支持等常规治疗；②观察组患者除此之外，进行高压氧疗，使用DG-2600型高压氧舱进行治疗，治疗压力：0 .25 MPa，吸纯氧30 min，休息10 min，再开始吸舱内空气，1次/d，21次/月，持续治疗3月；并且在骨折周围肌肉注射鼠神经生长因子[武汉海特生物制药股份有限公司，S20060051，20μg(不低于9000AU)/2 mL/瓶]，剂量：20μg/d，持续治疗3月。

1.3 观察指标

观察指标：①比较两组患者疗效；②比较两组患者骨密度及红细胞聚集指数、血浆黏度、红细胞刚性指数等血液流变学指标；③比较两组患者sICAM-1、TGF-β1、sVCAM-1、IGF-1、PDGF水平；④比较两组OPG/RANKL蛋白表达。

1.4 检测方法及疗效标准

检测方法：抽取患者空腹静脉血，离心处理后取上清液采用ELISA 试剂盒(上海一基实业有限公司)检测患者血清sICAM-1、TGF-β1、sVCAM-1、IGF-1、PDGF水平；采用BM830全自动血液分析仪(济南汉方医疗器械有限公司)检测患者红细胞聚集指数、血浆黏度、红细胞刚性指数等血液流变学指标。骨密度检测：3个月后，计算尺桡合并的骨密度(BMD)，采用骨密度仪(韩国，型号: EXA-PRESTO) 检测两组患者非优势侧前臂桡尺骨远端的骨密度。

OPG/RANKL蛋白表达检测：抽取患者空腹静脉血，采用BCA法测蛋白浓度。行膜转印和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，单孔上样量为10μg。转染后采用浓度为3%的脱脂牛奶封闭NC膜90 min。一抗孵育，过夜且温度保持为4 ℃，Anti-OPG浓度为1∶2000，Anti-RANKL浓度为1∶3000。TBST清洗后进行二抗孵育，温度为4 ℃并保持90 min，Goat Anti-Rabbit IgG的浓度为1∶3000。孵育完成后采用化学发光法显影，β-actin的灰度比与目的基因测量采用灰度分析软件Image J。所用仪器：水平电泳及其配套装置由英国CLEAVER公司提供；蛋白印迹转移装置由南京科佰生物科技有限公司生产。试剂盒：总蛋白提取试剂盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，BCA蛋白浓度测定试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供，Anti-RANKL及Goat Anti-Rabbit IgG由优宁维公司提供。

疗效评定[9]：愈合：①骨折端局部无异常活动，无纵向叩击痛和压痛；②外固定拆除后，对于下肢骨折患者，不扶拐时可在平地上连续步行3 min且不少于30 步，对于上肢骨折患者：持重1 kg，可坚持超过1 min；③复查X 线显示大量骨痂生长，骨折线模糊，连续性骨痂通过骨折线；④连续观察2 周骨折处不变形。好转：局部纵向叩击痛和压痛减轻，复查X 线显示中等量或少量骨痂生长，骨折线轻度模糊，但骨折端无硬化现象，功能部分改善。无效：临床症状无减轻，复查X 线示骨折线无改善或不愈合，功能无改善。治疗有效率=(治愈+好转)/总例数×100%

1.5 统计学处理

实验获取的数据录入SPSS 22.0统计学软件，计量资料表示为均数±标准差，进行t检验。计数资料以率(n%)表示，行χ2检验，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者骨折愈合情况比较

观察组治疗后1、2、3个月及6个月骨折愈合率均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组患者骨折愈合情况的比较[n(%)]Table 1 Comparison of fracture healing between the two groups [n(%)]

2.2 两组治疗前后血液流变学指标比较

治疗前，两组患者的骨量以及红细胞聚集指数、血浆黏度、红细胞刚性指数水平比较，差异均无统计学意义 (P>0.05)；治疗后，两组治疗结果均优于该组治疗前(P<0.05)，其中观察组明显低于对照组，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 治疗前后两组患者血液流变学指标的比较Table 2 Comparison of hemorheological indexes between the two groups before and after treatment

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.01。

2.3 两组治疗前后血清黏附因子及BMP-2水平的比较

治疗前，两组患者sICAM-1、BMP-2、sVCAM-1水平差异无统计学意义 (P>0.05)。治疗后，两组治疗结果均优于该组治疗前(P<0.05)，其中观察组显著高于对照组，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 两组患者化疗后血清黏附因子及细胞因子水平的比较Table 3 Comparison of serum adhesion factor and cytokine levels between two groups after chemotherapy

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.01。

2.4 两组治疗前后TGF-β1、IGF-1及PDGF水平的比较

治疗前两组TGF-β1、IGF-1及PDGF水平差异无统计学意义 (P>0.05)，治疗后两组以上细胞因子水平均较治疗前有所上升，且观察组TGF-β1、IGF-1及PDGF水平显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 两组治疗前后TGF-β1、IGF-1及PDGF水平的比较Table 4 Comparison of TGF- β1, IGF-1, and PDGF levels before and after treatment

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.01。

2.5 两组OPG/RANKL蛋白表达的比较

治疗前两组OPG/RANKL蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后观察组OPG/RANKL蛋白表达显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 OPG与RANKL蛋白的SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.1 SD-polyacrylamide gel electrophoresis of OPG and RANKL proteins

图2 OPG/RANKL 蛋白表达量的柱状统计图**P<0.001Fig.2 Columnar statistics of OPG/RANKL protein expression,**P<0.001

3 讨论

骨质疏松症的特征是骨量减少和骨组织结构退化，导致骨脆性增加，骨折危险性升高。骨折愈合是骨折康复过程的一个重要阶段，愈合效果也决定着患者术后生活质量[8]。近年研究[9]表明，骨折愈合是机体全身多系统参与的复杂过程，其中微循环指标和生化因子起着重要作用。根据骨折部位和严重程度的差异，骨折愈合时间长短不一，一般在4月以内，但骨质疏松症导致骨折处血运障碍，骨结痂所必须的各种生长因子运输受阻，最终造成骨折延愈合[10]。骨折延迟愈合会使患者康复时间延长，住院时间增加，不仅增加了患者经济负担，还降低了患者生活质量。因此，增加骨量、促进骨吸收、维护骨形成对加速骨质疏松性骨折愈合具有重要意义。

骨重建中，维持骨量需要成骨细胞和破骨细胞共同促进骨吸收和维护骨形成，成骨细胞可分泌骨基质，从而对骨生成具有促进作用。此外，研究[11]还发现，多数骨吸收因子无法直接诱导破骨细胞，其促进骨吸收必须经成骨细胞分泌的RANKL转导，因此成骨细胞既决定骨生成也具有调控骨吸收的作用。同时OPG也为成骨细胞分泌的骨基质，其可与RANK竞争与RANKL相结合，从而对骨吸收产生抑制作用[12]。动物实验[13]证实，OPG敲除可有效建立骨质疏松模型，补充外源性OPG可促进骨吸收和增强骨密度及骨强度的作用。OPG蛋白是RANKL(核因子κB受体活化因子配体)的饵受体，是由成骨细胞及骨髓基质细胞分泌产生，其在骨骼系统的生长和愈合中，可抑制破骨细胞的过度产生、分化和成熟，竞争性结合RANKL，从而抑制RANKL与RANK结合，并诱导破骨细胞凋亡。OPG/RANKL蛋白系统的表达，能够有效的调控破骨细胞的生成，一般来说，当OPG/RANKL的比值上升，破骨细胞的数量和活性将减少，OPG/RANKL的比例下降时，破骨细胞的数量和活性将增加。因此RANK/OPG/RANKL系统可有效调节骨质代谢，与骨质疏松等骨科疾病的发病机制密切相关。血清sVCAM-1和sICAM-1 是细胞外基质和细胞间的黏附因子，是一种微炎性反应因子，其水平的变化能够反映骨折愈合过程中的炎症反应；PDGF、IGF-1 是常见的骨生长刺激因子，能够调节间充质细胞的增殖、分化，促进软骨细胞增生，对骨折愈合过程中的软骨内成骨和膜内成骨均有促进作用[14]。TGF-β1是一种细胞因子，生物体发生骨折后，骨折端TGF-β1被激活，并通过促进成骨细胞形成，抑制破骨细胞生成，发挥促进骨折愈合的作用[15]。因此，TGF-β1能够反映患者骨折愈合情况。

高压氧疗是一种物理治疗方法，研究[16]表明，在高压环境中患者吸入纯氧能够提高血氧张力，氧分子在体内弥散距离增加，深度加大，能够有效提高血运障碍的延迟愈合骨折端的氧供水平。高压氧环境能够促进患者骨折端毛细血管增生，形成有效的侧枝循环，恢复骨折处血供。有研究[17]表明，高压氧治疗还能够减轻骨折处炎症反应，促进骨痂钙、磷等电解质沉积，加速骨痂胶原蛋白生成，从而加速血肿机化，促进骨折愈合。神经生长因子是一种多功能因子，骨折后骨折部周围神经系统被破坏，骨骼肌缺乏神经营养而萎缩，直接阻断了骨折处血供，导致骨折延迟愈合。通过注射神经生长因子，周围神经得到再生，间接促进了骨折处血供恢复，促进其愈合。同时，神经生长因子具有增强成骨细胞增生的能力，促进血管内皮细胞因子生成和骨折处新生血管形成，有利于骨折愈合[18]。

本研究中，观察组患者的治疗总有效率为95.42%，显著高于对照组(76.19%)。治疗后，观察组患者骨量明显回升，骨密度增加，而且红细胞聚集指数、血浆黏度、红细胞刚性指数水平均明显优于对照组；而且观察组患者微循环指标发生显著改善，血浆黏稠度明显降低，这可能与高压氧疗和神经因子帮助患者骨折端建立了新的血运有关[19]；血浆黏稠度减低后，骨折局部微循环得以改善，氧供恢复，避免了患者发生深静脉血栓，同时促进了患者骨折愈合。治疗后，观察组患者的sICAM-1、TGF-β1、sVCAM-1水平显著高于对照组，观察组患者的IGF-1、PDGF水平显著低于对照组，这与蔡三等[20]的研究结果一致。通过高压氧疗和局部神经因子注射，患者骨折端血供显著改善，间充质细胞的快速增殖、分化，同时大量的成骨细胞生成促进了膜内成骨和软骨内成骨的发生，有助于患者骨痂愈合。总之，OPG/RANKL的比值越大，成骨细胞的介导能力就越强，促进骨生成的作用越大。OPG/RANKL系统的平衡是骨重建和骨量稳定的基础，也是评估骨重塑过程的指标[21-22]。本研究结果显示，治疗后观察组OPG/RANKL蛋白表达显著高于对照组，提示高压氧联合神经生长因子局部注射可促进骨生成，进而加速骨折愈合。

综上所述，高压氧联合神经生长因子局部注射能够显著改善骨折延迟愈合患者血清黏附因子及微循环指标，提高疗效，促进骨折愈合，值得在临床推广。