转基因动物

白新磊

1.转基因 狭义：人为将DNA片段插入基因组 广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定点突变等 。

2.转基因动物： 指染色体基因组中整合有外源基并能稳定遗传给后代的一类动物。

3.嵌合体动物（Chimeric animal）：部分组织细胞中整合有外源基因组的动物。

4. 转基因动物方法： 显微注射法，逆转录病毒法，ES（胚胎干细胞）法，精子载体法

脂质体载体法，电脉冲法，基因枪法，核移植技术（转基因克隆技术）

5.常见转基因技术

常规方法：①受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性

②利用精子转染DNA，效率低，重复性差

③利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受限多

④病毒感染：效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患，常用于大动物

⑤干细胞/胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，费时，大动物不成功

⑥核移植/动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径

⑦CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效基因组修饰技术

6.转基因载体构建： 启动子选取 cDNA选取  Poly A 选用  内含子和封闭区  载体构建

7.逆转录病毒法： 1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的總称。2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。

原理： 1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。

2、逆转录病毒能作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。

关键步骤：（1）逆转录病毒载体的构建  ①提取病毒DNA②将DNA克隆载体中③酶切病毒结构蛋白编码区④将外源目的基因克隆到载体⑤转染细胞，测定外源基因的表达。  （2）包装细胞 决定着重组病毒效价及其宿主范围。  常用φ-2细胞株（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎  载体转染包装细胞后与8细胞胚胎共培养进行转染（4）胚胎移（5）建系

8.胚胎干细胞介导法： 1、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞。2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。

原理： 将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假

孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。

关键步骤： ①ES细胞的分离培养②ES细胞基因操作 电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法 ③获取囊胚期胚胎④显微操作 ES细胞注射到囊胚期胚胎内 ⑤胚胎移植

9.显微注射法 优点： 1、整合率相对较高2、可导入基因片断较长3、外源基因整合于所有的组织细胞中的概率高 缺点： 1、整合率随机2、有些动物原核看不清，需经特殊处理才能有效导入3、需较精密仪器，费用昂贵

10.逆转录病毒法 优点：1、胚胎存活率高2、病毒DNA随机单拷贝整合3、宿主范围广

缺点： 1、整合率不高，整合位点是随机的2、后代多为嵌合体动物3、外源基因易发生重排或丢失4、病毒载体容量不大5、病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达

11.ES细胞法 优点： 1、整合率可控2、可用多种方法将外源基因导入ES细胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便3、ES细胞注入囊胚及囊胚移植到子宫，操作比较简便

缺点： 1、ES细胞系培养、保存和维持不易2、后代多为嵌合体3、所需时间较长

12.体细胞克隆： 将体细胞核移入去核的卵母细胞中，使卵母细胞被刺激、分裂并发育成个体，使得核供体的基因得到完全复制。

体细胞克隆的主要程序与胚胎细胞克隆基本相同，其主要差别在供体细胞的选择

血清饥饿法：在血清浓度从10℅降至0.5℅的培养液中培养5d诱导至静止期然后移入去核卵母细胞，恢复体细胞的全能性。

13.转基因关键技术： 外源目的基因的制备 外源目的基因的有效导入 受精卵（胚胎）培养与移植 外源目的基因表达的检测等

14. Gene knockout（基因敲除）：是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。

15.基因治疗： 指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法。

16.生物反应器：将药用蛋白或具有特殊意义的蛋白质基因导入动物的受精卵或早期胚胎，培育成转基因动物，使之在动物体内（如乳腺、血液等）高效表达，生产出天然活性蛋白，这种转基因动物就称之为动物生物反应器。

17. 基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。

18. 基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。

19. 基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。

20. 基因组编辑技术（genome editing）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。