不同产地甜橙果皮提取物抗氧化活性成分及能力研究

李 娟 牛泽宇 - 岳湘齐 - 谢 璇 付鑫景 - 陆 俊

(1. 特医食品加工湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；2. 中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

中国是世界上最大的柑橘产区，大多数柑橘类产品都是新鲜食用或制成果汁，每年都会产生大量柑橘皮等残留物。柑橘皮含有酚酸、类黄酮、单宁和VC等抗氧化活性成分，蒲玲玲等[1]发现赣南脐橙皮中的酚酸成分主要为魏酸、咖啡酸、香豆酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸和香草酸。张磊[2]利用超声波法提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物，得率为 3.01%。未脱脂橙皮中的VC含量平均值达到了3.46 mg/g[3]。祝爱艳等[4]发现赣南脐橙幼果中总酚和总黄酮含量分别为11.02～17.14 mg/g和5.01～7.60 mg/g。黄酮类化合物已被证明具有很强的抗氧化活性[5]和抗炎[6]等活性作用。现已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有60余种，常见的有橙皮苷、新橙皮苷、桔红素、橙皮素、柚皮苷和川陈皮素等二氢黄酮[7]。橙皮苷是对心血管、对肾脏系统都具有显著的药理活性[8]，抑制人体肝癌等癌症细胞的增殖[9]，柚皮苷、新橙皮苷分别具有降低血糖的功效[10]，川陈皮素和桔红素是多甲氧基黄酮的重要代表成分，具有丰富的药理学活性[11]。中药陈皮就是由柑橘和柑橘的干燥成熟柑橘皮组成。柑橘皮还可作为香精油[12]、橙皮色素[13]、果胶[14]、橙皮苷[15]的生产原料，残渣还可用作禽畜饲料[16]。甜橙又是柑橘的主要品种，其年产量约占柑橘产量的2/3，而冰糖橙和脐橙又是甜橙的主要品种，产量丰富，极具开发利用价值。

目前有关甜橙果皮的活性成分及抗氧化活性研究侧重于对不同桔类与橙类皮的研究[17-18]，而对于多种甜橙皮活性及抗氧化比较鲜有报道。张东峰等[18]对湖南部分脐橙和冰糖橙果皮的多酚黄酮含量进行了研究，但未利用HPLC对其具体组分进行检测。试验拟以湖南8种甜橙皮作为研究对象，对其抗氧化主要成分黄酮、多酚、单宁及VC含量和抗氧化能力进行检测，比较不同地区橙皮抗氧化活性的差异，并分析抗氧化成分与抗氧化活性的相关性，最后通过主成分分析和系统聚类分析对8种不同甜橙进行初步分类，为甜橙皮的加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

麻阳冰糖橙、麻阳脐橙：麻阳万盛生态农业发展有限公司；

永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、石门冰糖橙、石门脐橙、邵阳脐橙、浏阳脐橙：购于长沙红星水果市场；

乙腈：色谱纯，美国天地有限公司；

福林试剂：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；

TPTZ(2，4，6-三吡啶基三嗪)：分析纯，南京都莱生物技术有限公司；

水溶性维生素E(Trolox)：分析纯，上海华蓝化学科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)：分析纯，日本东京化成工业株式会社；

2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)：分析纯，合肥博美生物有限公司；

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、桔红素：色谱纯(≥98%)，成都曼思都生物科技有限公司；

其他均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：LC-20A型，日本岛津有限公司；

超声波细胞粉碎机：JY92-Ш型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

旋转蒸发仪：R-3型，瑞士Buchi Labortecknic AG公司；

总而言之，国内人造金红石制备过程中总体呈现出以下问题：产品粉化严重；盐酸再生回收利用困难；设备腐蚀严重。

紫外可见光光度计：UV1800型，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甜橙皮的预处理与提取 将新鲜甜橙除去橙皮上的灰尘、泥土后，手工剥皮并放在阴凉通风处阴干后，再放入鼓风烘箱中在40 ℃条件下烘干24 h，用粉碎机粉碎过60目筛，得到粉末样品贮存于-20 ℃冰箱。样品的提取参考黄运红等[19]的方法并略为修改，精确称取3.00 g橙皮粉末置于烧杯中，按照料液比1∶35 (g/mL)的比例加入105 mL 60%的乙醇，在功率125 W，温度50 ℃条件下进行超声波辅助提取1 h。将样液抽滤后并用旋转蒸发仪在50 ℃温度下去除乙醇，浓缩液贮藏于-4 ℃冰箱待用。

1.3.2 抗氧化活性成分含量测定

(1) 多酚含量：参考文献[20]的方法进行测定，以每克干样品中没食子酸当量(mg GAE/g·样品干重)表示。

(2) 黄酮含量：参照文献[21]的方法进行测定，以每克干样品中芦丁当量(mg RE/g·样品干重)表示。

(3) 单宁含量：参照文献[22]的方法进行测定，以每克干样品中单宁酸当量(mg TAE/g·样品干重)表示。

(4) VC含量：参照文献[23]的方法进行测定，结果以mg/g·样品干重表示。

1.3.3 抗氧化活性检测

(2) 铁离子还原能力(FRAP)：参考Lu等[25]的方法。

(3) ABTS+·清除能力：参考Oh等[26]的方法，

抗氧化能力均采用每克干样品中Trolox当量表示，单位为μmol TE/g·样品干重。

1.3.4 橙皮中黄酮类化合物的检测 采用HPLC测定橙皮中黄酮类化合物[27]。色谱条件：LC-20A高效液相色谱仪，色谱柱为安谱 CNW Athena C18-WP Symmetry (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，检测波长254 nm。流动相为1%乙酸水(A) 和甲醇(B)，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL。流动相梯度洗脱程序为0～18 min，20%～70% B；18～25 min，70%～80% B；25～26 min，80%～20% B；26～35 min，20% B。

1.3.5 统计分析 方差分析由SPSS 17.0统计软件进行，数据表示为[平均值±标准偏差(SD)]。利用XLSTAT 2015软件进行主成分分析和系统聚类分析，采用Pearson相关系数进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 橙皮中抗氧化活性成分含量

橙皮中的多酚、黄酮、单宁和VC含量见表1。由表1可知，8种甜橙皮中的抗氧化成分含量具有显著性差异(P<0.05)。多酚含量在5.470～7.596 mg GAE/g·样品干重，黄酮含量在3.033～4.566 mg RE/g·样品干重，单宁含量在8.893～17.900 mg TAE/g·样品干重，VC含量在13.236～17.858 mg/g·样品干重，高于台湾品种Liucheng (C.sinensisL.)的黄酮含量(1.51 mg/g·样品干重)[28]。

8种甜橙皮中，以麻阳冰糖橙皮的多酚含量最高，其次是浏阳脐橙。同时，麻阳冰糖橙皮中黄酮含量也最高，其次是洪江冰糖橙，永兴冰糖橙和浏阳脐橙。VC含量和黄酮含量的排序较相似，也是以麻阳冰糖橙>永兴冰糖橙>洪江冰糖橙>浏阳脐橙的顺序排列。单宁含量最高的仍为麻阳冰糖橙皮，洪江冰糖橙单宁含量稍低于麻阳冰糖橙皮，邵阳脐橙皮多酚含量最低，仅为麻阳冰糖橙皮单宁含量的1/2。由此可知，麻阳冰糖橙皮具有比其他冰糖橙皮更多的抗氧化活性成分含量，也显著高于麻阳脐橙皮活性成分的含量。值得注意的是洪江冰糖橙，麻阳冰糖橙和石门脐橙3种橙皮中4种抗氧化成分的含量均按以下顺序排列：单宁>VC>多酚>黄酮，而在其他样品中排列顺序则为：VC>单宁>多酚>黄酮。

2.2 橙皮主要黄酮类化合物鉴定

6种黄酮类化合物的线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限(LOD)和定量限(LOQ)见表2。结果表明，各标准品在浓度范围内呈良好的线性关系，且检测限LOD和定量限LOQ值均低于4 mg/L，说明该液相检测方法有很高的灵敏度。

表1 8种甜橙皮中抗氧化活性成分含量†

† 同列上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表2 6种黄酮类化合物的标准曲线†

†y为峰面积，x为标准品浓度(mg/L)。

8种甜橙皮样品的HPLC谱图见图1，根据标准曲线计算所得样品中各黄酮类化合物的含量见表3，除了新橙皮苷未检出外，其他5种化合物在8种甜橙皮中都能检出且存在显著差异，与黄寿恩等[27]在温州蜜柑皮中也未检测到新橙皮苷结果类似。Wang等[11]报道橙皮苷是柑橘皮中最主要的黄烷酮糖苷，刘贤青等[29]对湖北省秭归县脐橙的研究发现黄皮层中以甜橙黄酮、川陈皮素和橘皮素等多甲氧基黄酮为主，而白皮层、囊衣和汁胞中的类黄酮以橙皮苷、柚皮苷为主。试验结果发现橙皮苷的含量比例也是最高的，橙皮苷范围为2.63～4.65 mg/g·样品干重，远高于甘南脐橙0.21 mg/g[30]和新干香橙0.51 mg/g[31]，也高于陕西汉中柑橘皮中的橙皮苷含量(0.33 mg/g)[32]，但低于奉节脐橙皮橙皮苷的含量(1.67%～3.76%)[33]。柚皮苷含量稍低于橙皮苷，含量范围为3.32～1.12 mg/g·样品干重，以麻阳脐橙的含量最高，是含量最低的石门脐橙皮的3倍左右。橙皮素含量范围为0.12～0.36 mg/g·样品干重，以邵阳脐橙含量最高，而川陈皮素和桔红素，均在永兴冰糖橙皮中含量最高，分别为(0.84±0.08)，(0.26±0.03) mg/g·样品干重。橙皮中黄酮种类和含量的差异可能是由橙子的品种或生长条件差异所造成的[6]。

S、A、B、C、D、E、F、G、H分别为混标及永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、石门冰糖橙、麻阳冰糖橙、石门脐橙、麻阳脐橙、邵阳脐橙、浏阳脐橙8种橙皮乙醇提取物色谱图，峰1～6分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、桔红素

图1 标准品混合物及8种甜橙橙皮提取液在254 nm处的HPLC-UV色谱图

Figure 1 HPLC-UV chromatograms of standards mixture and ethanol extracts of 8 sweet orange peel at 254 nm

表3 8种甜橙皮主要黄酮类化合物含量的比较†

† 同列上标字母不同表示差异显著(P<0.05)；-表示未检出。

2.3 8种甜橙皮提取物抗氧化活性分析

8种甜橙皮提取物的抗氧化活性结果见图2。由图2可知，8种甜橙皮中的抗氧化活性具有显著性差异(P<0.05)。DPPH·清除能力为11.39～33.24 μmol TE/g·样品干重。其中，DPPH·清除活性最高的为邵阳脐橙皮[(33.24±0.57) μmol TE/g·样品干重]，稍高于麻阳脐橙的[(32.68±1.26) μmol TE/g·样品干重]，以石门冰糖橙皮最低；FRAP以麻阳冰糖橙皮的最高，其值为(81.45±0.93) μmol TE/g·样品干重，约为石门脐橙[(41.93±0.87) μmol TE/g·样品干重]的2倍，ABTS+· 清除能力在32.40～93.15 μmol TE/g·样品干重，其抗氧化活性最高的为永兴冰糖橙皮，其次为洪江冰糖橙，也以石门脐橙皮最低。综合比较表明，永兴冰糖橙和麻阳冰糖橙具有较显著的抗氧化活性，这些较高的抗氧化活性可能与提取物中较高的黄酮类化合物含量有很大的关系。

A、B、C、D、E、F、G、H分别为永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、石门冰糖橙、麻阳冰糖橙、石门脐橙、麻阳脐橙、邵阳脐橙、浏阳脐橙；同一指标字母不同表示差异显著(P<0.05)

图2 8种甜橙皮中的抗氧化能力

Figure 2 Antioxidant activity of 8 kinds of sweet orange peels

2.4 抗氧化活性成分与抗氧化活性相关性分析

甜橙皮的抗氧化活性(DPPH、FRAP和ABTS)与抗氧化活性成分(多酚、黄酮、单宁和VC)之间Spearman相关性分析结果见表4。3种抗氧化活性与多酚、黄酮、单宁和VC4种活性成分都存在显著(P<0.01)的相关性，但抗氧化活性与各抗氧化成分的相关系数均低于0.8，为中度或低度相关，可能与这些活性成分的相互作用有一定的关系。同时结果表明，多酚与黄酮的含量之间存在很强的相关性(r=0.905，P<0.01)，说明甜橙皮中黄酮的含量所占总多酚含量比例最大。

表4 抗氧化活性成分和抗氧化活性斯皮尔曼相关系数

† **表示在P<0.01水平有显著性差异。

2.5 主成分和聚类分析

以抗氧化活性成分及抗氧化活性为变量，采用SPSS 17.0软件进行主成分分析，由图3可知，第1主成分具有最大的特征值4.057，能解释57.960%的总变异；第2、第3、第4主成分特征值分别为1.069，0.910，0.646，能解释总变异的值分别为15.265%，12.995%，9.230%。前4个主成分能解释95.450%的总变异。因此，可以选择F1、F2、F3和F4主成分作为评价指标。因子载荷阵(表5)是来自于主成分的原始变量(多酚、黄酮、单宁、VC、DPPH、FRAP和ABTS)和因子之间的相关性。这些数据代表着抗氧化活性成分和抗氧化能力对总变异的贡献。基于Hair等[34]主成分分析理论，载荷因子值≥0.7可用来确定最重要变量和主成分。由表5可知：第1主成分反映的主要指标有：多酚(0.848)、黄酮(0.938)、单宁(0.817)、VC(0.902)；第2主成分反映的主要指标有VC(-0.058)、DPPH(-0.566)、FRAP(-0.353)和ABTS(-0.495)；第3主成分反映的主要指标有：VC(0.334)和DPPH(0.702)；第4主成分反映的主要指标为FRAP(0.593)和ABTS(-0.492)。因此，第一主成分主要由多酚、黄酮、单宁和VC来贡献的，这些指标可作为橙皮聚类的重要指标。

根据8种不同产地甜橙彼此之间的差异性进行聚类分析，结果见图4。结合聚类分析结果可知：8种甜橙大致被分成了三类。由于永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、麻阳冰糖橙和浏阳脐橙皮中的多酚、黄酮、单宁和VC含量最高，FRAP和ABTS抗氧化活性也最大，被归为Ⅰ类；石门冰糖橙和石门脐橙皮中含有较多的多酚、黄酮和VC，被归为Ⅱ类；麻阳脐橙和邵阳脐橙皮中的抗氧化活性物质含量较低，被归为Ⅲ类。8种甜橙由于产地和品种不同，橙皮中抗氧化活性物质的含量和抗氧化活性大小不同。因此甜橙皮中抗氧化活性物质的含量及其抗氧化活性可以作为区分不同产地甜橙的重要指标。

表5 因子载荷阵

TT、TP、TF、VC分别为总单宁、总酚、总黄酮和VC；DPPH、ABTS、FRAP分别为DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性；A、B、C、D、E、F、G、H分别代表永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、石门冰糖橙、麻阳冰糖橙、石门脐橙、麻阳脐橙、邵阳脐橙和浏阳脐橙

图3 8种甜橙皮的得分图

Figure 3 Score plot of 8 kinds of sweet orange peels

A、B、C、D、E、F、G、H分别代表永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、石门冰糖橙、麻阳冰糖橙、石门脐橙、麻阳脐橙、邵阳脐橙和浏阳脐橙

图4 聚类分析树状图

Figure 4 Dendrogram for sweet orange peels obtained from the hierarchical cluster analysis

3 结论

抗氧化活性成分分析结果表明8种甜橙橙皮中多酚、黄酮、单宁和VC等抗氧化成分具有显著性差异(P<0.05)。其中以麻阳冰糖橙皮中的黄酮含量、单宁含量和VC的含量都是最高，HPLC检测结果显示8种甜橙的橙皮中黄酮类化合物含量也有显著性差异，其中含量最高的为橙皮苷，最低的为新橙皮苷。抗氧化活性结果也表明不同产地和不同品种的甜橙皮中的抗氧化活性具有显著性差异(P<0.05)，综合比较可知永兴冰糖橙皮和麻阳冰糖橙皮具有相对较显著的抗氧化活性，Spearman相关性分析表明甜橙皮的抗氧化能力与抗氧化活性成分之间存在显著相关性(P<0.01)。通过系统聚类和综合主成分分析法，8种甜橙大致可分成三类，第Ⅰ类：永兴冰糖橙、洪江冰糖橙、麻阳冰糖橙和浏阳脐橙；第Ⅱ类：石门冰糖橙和石门脐橙；第Ⅲ类：麻阳脐橙和邵阳脐橙。湖南作为柑橘生产大省，有着丰富的柑橘品种和产量，尤其是有着中国冰糖橙之乡美誉的麻阳县，冰糖橙产量全国第一，而大部分以鲜食为主，因此加大对冰糖橙和脐橙皮中抗氧化活性成分和黄酮类化合物的含量差异及抗氧化活性能力的研究，提高甜橙皮深加工很有必要。