山茱萸多糖对匹鲁卡品致痫大鼠学习记忆能力的影响及机制

1.河南省南阳市第二人民医院神经内科，河南 南阳 473000；2.河南省南阳医学高等专科学校基础医学部，河南 南阳 473000

癫痫是脑部神经元异常放电所导致的大脑功能失调，流行病学调查资料显示，其患病率为4‰～10‰，约有病人5千万，其中难治性癫痫约占20%[1]。难治性癫痫患者中以颞叶癫痫最为常见，表现为自发性反复痫性发作，导致不同程度的学习和记忆功能障碍[2]。因此，积极寻找改善癫痫患者学习记忆能力的方法显得尤为重要。癫痫的具体发病机制不清，氧化应激导致的细胞死亡在癫痫的产生中起重要作用[3]。山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，于秋末冬初成熟，别名山萸肉、蜀枣、石枣、萸肉、枣皮、药枣等，味酸涩，性味酸涩，有固虚脱、涩精气、补肝肾的功效，为我国传统珍贵的滋补良药，临床上主要用于肝肾功能不全导致的腰酸背痛、乏力以及元气虚脱引起的心悸、盗汗等[4]。山茱萸多糖为中药山茱萸中提取的有效成份之一，现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、增强免疫、抗休克、降血糖、抗氧化、抗衰老等多方面的作用[5]，研究发现其具有提高多种疾病学习记忆能力的作用[6-7]，但是否能够提高难治性癫痫患者的学习记忆水平，还未见相关报道。因此，本实验拟通过建立锂-匹鲁卡品诱导大鼠癫痫模型，应用morris水迷宫检测山茱萸多糖对癫痫大鼠学习记忆能力的影响，从氧化应激角度分析其作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康清洁级S-D大鼠30只，雄性，体重200～300 g左右，购于河南省医学动物中心，编号：201861035。分组饲养，室温控制在20～25 ℃，空气湿度控制在50%～55%，饮食与饮水均标准化供给，所有实验大鼠均适应性喂养1 w后开始建模。

1.2 药品和试剂 山茱萸多糖(南阳医学高等专科学校药学实验室惠赠，临用前用蒸馏水配制成0.05 g/mL)；匹鲁卡品(批号：17023654，Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)皆购自于南京建成生物公司，试剂批号皆为20180713。

1.3 仪器 WMT-100型Morris水迷宫(四川成都仪器厂)；UV-2501分光光度计(日本岛津)。

1.4 方法

1.4.1 颞叶癫痫模型建立 采用经典氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型制备，参考文献[8]，具体方法如下：首先腹腔注射127 mg/kg的氯化锂，12 h后腹腔注射10 mg/kg阿托品，30 min后腹腔注射100 mg/kg匹鲁卡品。如果大鼠癫痫持续发作超过1 h，或者出现严重抽搐则需要腹腔注射苯巴比妥至癫痫发作停止。根据经典发作标准，癫痫发作在Ⅳ级以上，且发作停止后状态良好，癫痫模型大鼠制备成功。

1.4.2 分组 30只大鼠随机分为对照组、癫痫模型组、山茱萸多糖干预组，各组10只。对照组采取常规饲养，不建立癫痫模型；模型组建立癫痫模型，常规饲养；山茱萸多糖干预组在建立癫痫模型后，采用0.28 g/kg 山茱萸多糖灌胃，持续灌胃14 d。

1.4.3 Morris水迷宫检测 灌胃14 d后，Morris水迷宫检测所有大鼠学习记忆能力，具体方法参考文献[6]。

1.4.4 氧化应激反应指标测定 水迷宫实验结束后，立即处死大鼠，快速在冰面分离大鼠海马组织，用生理盐水将取出的海马组织制成10%匀浆，-80 ℃保存。严格按照试剂盒使用说明，采用化学比色法检测海马组织中SOD、MDA和GSH-PX含量。

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验

2.1.1 水迷宫定位航行实验结果 与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期时间明显延长(P<0.05)；与模型组比较，山茱萸多糖干预组大鼠逃避潜伏期时间明显缩短(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组大鼠定位航行实验结果

组别第1天/s第2天/s第3天/s第4天/s对照组77.35±8.36 68.26±7.23 59.85±5.45 48.25±5.13模型组99.65±9.84∗90.28±8.66∗80.69±7.65∗69.46±6.12∗山茱萸多糖干预组82.68±11.36# 72.48±10.16 #64.39±10.32# 54.67±8.39#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.1.2 水迷宫空间探索实验 与对照组比较，模型组大鼠平台象限路径百分比与平台象限停留时间明显缩短(P<0.05)；与模型组比较，山茱萸多糖干预组大鼠平台象限路径百分比与平台象限停留时间明显延长(P<0.05)。见表2。

组别平台象限路径百分比/%平台象限停留时间/s对照组58.32±6.21 25.32±5.13 模型组32.19±4.66∗15.69±2.38∗山茱萸多糖干预组49.29±8.39# 20.26±6.78#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 海马组织SOD、MDA、GSH-PX含量测定 与对照组比较，模型组大鼠海马组织SOD、GSH-PX含量明显降低(P<0.05)，MDA含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，山茱萸多糖干预组大鼠SOD、GSH-PX含量明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)。

组别SOD/NU/mgMDA/nmol/mgGSH-PX/U/g对照组90.36±12.58 0.86±0.25 75.28±11.29 模型组54.78±9.32∗1.69±0.52∗45.25±9.68∗山茱萸多糖干预组74.58±11.83#1.18±0.75#66.76±9.97#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

颞叶癫痫为难治性癫痫中最常见的一种类型，氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型是公认的最接近人类颞叶癫痫的动物模型[9]。70%颞叶癫痫患者都会伴随不同程度的学习记忆功能障碍[2]。Morris水迷宫是目前世界公认的较为客观的学习记忆功能评价方法，主要包括：定位航行实验和空间探索实验。通过本实验研究发现，与对照组比较模型组大鼠逃避潜伏期时间明显延长、平台象限路径百分比与平台象限停留时间明显缩短(P<0.01)，提示癫痫大鼠学习记忆能力水平明显下降；而与模型组比较，山茱萸多糖干预组逃避潜伏期时间明显缩短(P<0.01)、平台象限路径百分比与平台象限停留时间明显延长(P<0.05或P<0.01)，提示山茱萸多糖明显提高癫痫大鼠的学习记忆能力水平。

氧化应激是癫痫发病机制中的重要过程。文献报道匹鲁卡品诱导的癫痫发作引起海马、纹状体等部位脂质过氧化物和NO含量升高，且在癫痫发生的早期出现SOD活力的下降[10]，从而导致海马神经元损伤。SOD与GSH-PX为脑组织内天然的抗氧化酶，具有清除自由基的作用，SOD与GSH-PX含量越低，自由基含量越高，脑内细胞氧化损伤越严重。MDA为自由基过氧化反应的终产物，具有细胞毒性，加剧细胞膜的损伤[11]，MDA含量越高细胞膜氧化应激损伤越严重。研究结果表明癫痫大鼠SOD与GSH-PX含量降低(P<0.01)、MDA含量明显升高(P<0.01)，提示癫痫大鼠海马组织内产生氧化应激反应。山茱萸为临床上广为使用的名贵中药，其有效成分多糖具有强抗氧化作用。通过本实验研究发现通过山茱萸多糖干预作用后，癫痫大鼠SOD、GSH-PX含量明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)，提示山茱萸多糖对癫痫大鼠具有抗氧化作用。

因此，山茱萸多糖具有提高癫痫大鼠学习记忆能力的作用，其机制可能是通过抗氧化作用来实现的。