荧光探针PCR技术诊断小儿呼吸道合胞病毒(RSV)的效果观察

聂曼杰

急性呼吸道感染是小儿时期的常见疾病,临床数据[1]统计显示95%以上的小儿急性呼吸道感染是由病毒导致的,而呼吸道合胞病毒(RSV)就是引发急性呼吸道感染的常见病毒之一。RSV感染主要是由于眼、口、鼻等部位的黏膜接触导致的,其中婴幼儿感染率更高[2-3]。随着病情的发展,小儿RSV感染除了上呼吸道感染,还可能导致肺炎、支气管炎等下呼吸道感染[4]。不同种类病原体的呼吸道感染的治疗方法不同,有效的病原体检测分类能为临床的准确治疗提供参考依据[5]。病毒分离培养是检测RSV感染的金标准,但是操作繁琐耗时,需要10 d左右才能得到检测结果,且检测费用高,临床应用受限。免疫荧光技术是目前检测RSV感染的常用方法,它是通过将抗原抗体特异结合的免疫学方法联合荧光标记技术进行检测的方法,但是检测RSV感染的特异度不够理想[6]。聚合酶链式反应(PCR)扩增技术是能对病原体的核酸分子进行定性和定量检测的一种方法。近年来,随着相关研究的不断深入,荧光探针PCR技术结合了PCR扩增反应和荧光标记的技术,是一种衍生的PCR技术,它在病毒感染性疾病的诊断中逐渐有所应用[7]。本次研究对荧光探针PCR技术检测小儿RSV感染的结果进行分析。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年1月我院儿科收治的175 例呼吸道感染患儿作为研究对象,其中男103例,女72例,年龄0.3～10岁,平均年龄(4.7±1.3)岁,病程4 d ～2 个月,平均病程(1.3±0.4)个月,其中急性支气管肺炎67例,毛细支气管炎71例,小儿哮喘37例。

1.2 方法 采用痰液收集器收集所有患儿的鼻咽吸出物,存贮于储液器内,使用Hank液进行吹打混匀后,以1 000 r/min的速度离心5 min,吸取上清液,并保存在－80 ℃环境下备用待检。所有受检的患儿均分别采用免疫荧光技术和荧光探针PCR技术检测患儿RSV感染的情况,并以病毒培养法进行明确诊断。

1.2.1 免疫荧光技术检测 吸取500 μL的鼻咽吸出物样本,加入5～8 mL的磷酸缓冲盐溶液,先置入旋涡混合器震荡3～5 min进行混合均匀,再以300～500 r/min的离心速度离心10 min。去除上清液后,收集下面的沉淀物再次加入5～8 mL的磷酸缓冲盐溶液并重复震荡和离心的操作。再次收集沉淀物后加入一定的磷酸缓冲盐溶液调成1.0×106的细胞悬液。吸收25 μL的细胞悬液加入8孔载玻片中,37 ℃条件下待其干燥后使用冷丙酮固定10 min。接着在玻片上滴加荧光抗体染色,室温下进行孵育0.5 h。然后采用磷酸盐吐温缓冲液连续冲洗3次玻片后再采用蒸馏水进行冲洗,去除多余的冲洗液,最后待玻片彻底干燥后在每个细胞点上加上1滴封片剂进行封片。在德国蔡司公司的AXIOVERT 40型荧光显微镜下观察载玻片上细胞点内的荧光情况。以出现荧光苹果绿视为PSV感染阳性,否则视为阴性。

1.2.2 免疫探针PCR 技术检测 吸取150 μL的鼻咽吸出物样本,选用德国Qiagen 公司的QIAmpRNA Mini Kit病毒RNA提取试剂盒按照其说明书进行提取样本中的病毒RNA。根据探针设计原则选择的引物为,上游：RSV-F：5'-GGA CAA GTT G TT GAG GTT TAT GAA TAT GC-3',下游：RSV-R：5'-T TC TGC TGT CAA GTC TAG TACACT GTA GT-3'。采用随机合成的引物将提取到的RNA合成cDNA,选用美国ABI公司的7500型荧光PCR仪放入反应管进行PCR扩增反应,设置的反应条件为：①42 ℃,8 min预变性。②94 ℃,30 s,55 ℃,30 s,72 ℃,45 s,35个循环。荧光素设定FAM,反应结束后通过扩增Ct值判断结果。

1.3 观察指标 统计免疫荧光技术和荧光探针PCR技术进行检测患儿RSV感染的情况,以病毒培养法的RSV感染结果作为诊断的金标准,比较免疫荧光技术和荧光探针PCR技术检测诊断患儿RSV感染的灵敏度、特异度以及准确性等诊断效能。灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数＋假阴性人数)×100%。特异度＝真阴性人数/(真阴性人数＋假阳性人数) ×100%。准确性＝(真阴性人数＋真阳性人数)/(真阴性人数＋假阴性人数＋真阳性人数＋假阳性人数)×100%。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0统计学软件进行数据的统计学分析,诊断效能等计数资料采用率表示,组间差异采用卡方检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法诊断RSV感染的结果比较(表1)175例呼吸道感染患儿中RSV感染阳性103例,其中男64例,占比62.14%,女39例,占比37.86%。免疫荧光技术检测诊断患儿RSV感染阳性98例,其中真阳性88例,荧光探针PCR技术检测诊断患儿RSV感染阳性104例,其中真阳性102例。

2.2 两种检测方法诊断RSV感染的诊断效能比较(表2) 免疫荧光技术检测诊断患儿RSV感染的灵敏度、特异度以及准确性分别为85.44%、86.11%、85.71%。荧光探针PCR技术检测诊断的灵敏度、特异度以及准确性分别为99.03%、97.22%、98.29%,两者相比荧光探针PCR技术检测诊断患儿RSV感染的各项诊断效能均优于免疫荧光技术检测,差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 两种检测方法诊断RSV感染的结果比较(n)

表2 两种检测方法诊断RSV感染的诊断效能比较 单位：%

3 讨论

数据统计,目前国内每年死于急性呼吸道感染的患儿约有10万,其中在部分经济发展较为滞后的省市急性呼吸道感染患儿的病死率更高,严重影响儿童的身体健康和生命安全[8]。根据感染病原体的不同,主要分为细菌感染和病毒感染,以后者的占比更大,高达90%。其中RSV是导致儿童急性呼吸道感染的常见病原体,也是目前全球范围内公认的诱发儿童急性肺炎和毛细支气管炎的最为主要的病原体[9]。在发生RSV呼吸道感染时,缺乏特异性的临床症状及表现,依靠其进行鉴别诊断的难度较高[10]。免疫学检测是RSV呼吸道感染检测的常用方法,免疫荧光技术应用于病毒抗体的检测已有30多年的历史,它通过对RSV病毒的特异性单克隆抗体采用荧光素标记后,利用抗体和病毒表面抗原的特异性结合的特点,在荧光显微镜下观察两者结合后的免疫复合物的荧光情况,从而对样本细胞中的病毒抗原和抗体进行准确定位和定量分析[11]。既往研究[12]显示,免疫荧光技术检测RSV病毒容易受到其他交叉抗原的影响,存在一定的假阳性或假阴性比例。PCR技术属于分子生物学检测方法,具有灵敏度高、漏检率低的特点,且PCR检测的速度快,能显著缩短窗口期的检测时间[13]。而荧光PCR技术结合了PCR和荧光探针两种技术,在PCR扩增反应体系中加入了荧光素染色剂,通过观察荧光信号直接进行模板浓度的定量分析,解决了传统PCR无法实时监控的问题,还能减少传统PCR中电泳、照相等操作中污染的发生率。另外荧光PCR技术结合探针法的特异性,靶序列受到引物和探针的双重控制,能减少非特异性扩增,进一步提高检测的特异度[14]。本次研究中,免疫荧光技术检测诊断患儿RSV感染的灵敏度、特异度以及准确性均低于荧光探针PCR技术检测诊断的灵敏度、特异度以及准确性,而探针PCR技术各项诊断效能均优于免疫荧光技术检测,差异有统计学意义(P＜0.05)。结果与俞松山等[15]的研究一致,显示相较免疫荧光技术检测小儿RSV感染相比,荧光探针PCR技术检测能有效避免免疫学检测中抗原的血清学交叉反应带来的假阳性和假阴性,从而提高诊断的灵敏度和准确度。

综上所述,相较免疫荧光技术检测小儿RSV感染相比,荧光探针PCR技术检测的灵敏度和准确度更好,具有临床推广的价值。