西红花苷通过TGF-β1和NF-κB通路抑制草酸引起的肾小管细胞上皮间质转化

刘亚东，于时良，刘健男，安瑞华

(哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150001)

草酸作为代谢终产物，是肾结石疾病发病机理中的重要影响因素[1]。高浓度的草酸会导致肾小管上皮细胞损伤，增加细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[2-3]。肾小管细胞中ROS的生成主要来源于线粒体和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)氧化酶，而线粒体功能紊乱被认为是草酸引起肾小管细胞损伤的关键[4]。所以具有抗氧化作用的药物被广泛用于防治肾小管损伤和肾结石形成[5]。

西红花苷是一种水溶性的类胡萝卜素，主要提取于栀子花、番红花[6]。许多药理研究已经证实了其具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、增加免疫的功能[7-8]。HADEER等[9]的研究证实西红花苷可以通过抑制氧化应激来缓解大鼠糖尿病肾的病情进展。但其在草酸钙肾结石防治中的研究尚鲜见相关报道。

本文从细胞试验层面多个角度研究西红花苷是否可抑制肾小管细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的形成，从而为西红花苷等中成药在肾结石疾病的防治中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料高糖DMEM合成液体培养基(美国Hyclone公司)，草酸(美国Sigma公司)，西红花苷(源叶生物公司)，兔抗人钙黏蛋白(E-cadherin)单克隆抗体、兔抗人波形蛋白(Vimentin)、兔抗人N钙黏蛋白(N-cadherin)单克隆抗体(万类生物公司)、兔抗人转化生长因子β1(transform growth factor β1，TGF-β1)抗体(Proteintech公司)、兔抗人核因子-κB (Nuclear factor kappa B，NF-κB)抗体(Cell Signaling Technology公司)，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(中杉金桥公司)，活性氧检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(中国碧云天生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养犬远端肾小管上皮细胞(Madin-darby canine kidney，MDCK)购自于中科院上海细胞库。将其培养于含10%胎牛血清和双抗的高糖DMEM培养液中，于37℃、5% CO2的培养箱中常规培养传代。待细胞生长至覆盖率为80%左右时分别予以草酸和西红花苷进行处理。研究共分为3组：正常对照组、草酸干预组、草酸+西红花苷干预组。

1.3 Western blot细胞模型构建完成后提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶法配制成10%的15孔凝胶。然后依次电泳、电转，用含5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，然后孵育E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、NF-κB抗体1 h，4℃冰箱过夜，次日摇床再次孵育1 h。再以PBST洗涤(每次10 min，共3次)后用HRP标记的二抗孵育1 h，再次用PBST洗涤后将PVDF膜放入Bio-Rad成像仪，选择合适的参数，滴加ECL发光液后进行显影，对结果运用Image Lab软件分析处理。

1.4 ROS检测细胞种植于6孔板中，待细胞生长覆盖率达到80%左右时，胰酶将细胞消化下来后放于15 mL无菌无酶离心管中，然后悬浮状态下分别予以相应药物刺激干预2 h。诱导完毕后先离心，然后用无血清培养液悬浮后再次离心，将残留的药物洗除。再次离心后加入含DCFH-DA探针的无血清培养液将离心管中细胞重悬，于37 ℃培养箱中孵育20 min，期间每间隔3～5 min吹打混合一次。然后各组取相同数目的细胞重悬于500 μL的PBS中。再用200目滤网过滤转移至流式BD管中，适度摇匀后上机检测。结果用流式分析软件分析计算，所有实验操作均3次以上。

1.5 细胞内SOD、MDA水平的测定SOD可以清除超氧阴离子自由基从而保护细胞免受损伤。由黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统所产生的超氧阴离子自由基可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，在550 nm处用酶标仪测其吸光度。计算公式为：0.5×(对照A值-测定A值)/(对照A值)×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。MDA-TBA加合物在535 nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。

2 结 果

2.1 各组干预后ROS发生率流式细胞仪检测发现(图1)，与正常组相比草酸会使ROS发生率增加4～5倍。而与草酸组相比，西红花苷组会降低草酸诱导所产生的ROS。

图1 各组干预后ROS发生率

A：流式细胞仪检测图；B：柱状图。*与正常组相比，P<0.05。

2.2 蛋白的表达情况与正常组相比，草酸干预会使波形蛋白(Vimentin)、神经-钙黏蛋白(N-cadherin)、TGF-β1、NF-κB表达升高；而上皮相关蛋白(E-cadherin)的表达在草酸组会降低(图2A～F)。

2.3 各组SOD、MDA表达量草酸可损伤肾小管上皮细胞，而西红花苷可缓解草酸所带来的损伤，故草酸组MDA的表达量高于正常对照组、西红花苷干预组。但SOD在草酸组的表达量降低，西红花苷组表达较草酸组增加(图3)。

图2 各组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、NF-κB蛋白的表达

A：E-cadherin(E-钙黏蛋白)、N-cadherin(N-钙黏蛋白)、Vimentin(波形蛋白)、TGF-β1(转化因子β1)、NF-κB(核因子-κB)蛋白的表达条带图；B、C、D、E、F分别为E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、TGF-β1、NF-κB蛋白表达水平柱状图。与草酸组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图3 各组SOD、MDA表达量

A：SOD(超氧化物歧化酶)各组表达水平；B：MDA(丙二醛)表达水平。*与正常组相比，P<0.05；**：与草酸组相比，P<0.01。SOD：超氧化物歧化酶。

3 讨 论

草酸钙结晶在肾结石成分中占有80%左右，在结石形成过程中，草酸钙结石经历结晶的生成、聚集最终粘附于肾小管上皮细胞上[10]。既往动物和细胞实验已经证实高浓度的草酸会增加细胞内的氧化应激，并且是肾上皮细胞损伤起始和进展的因素之一[11]。同时，活性氧导致的肾小管细胞和动物模型肾脏的损伤反过来会进一步促使草酸钙肾结石的形成[12]。因此，关于抗氧化剂缓解草酸造成的细胞损伤被大量的研究。

由TGF-β刺激所导致的EMT改变了基因表达，减弱了细胞粘附，触发了细胞骨架动力学的变化，并使得上皮细胞的形态和生理功能改变为间质细胞的表型[13]。EMT包括E-cadherin表达和功能的减弱，同时间质化的指标N-cadherin、Vimentin表达增加。EMT在组织修复、肿瘤生长和侵袭中发挥了重要作用[14]。DENG等[13]的研究证实了起始于肾小管上皮细胞的肾结石与高浓度的草酸钙环境和TGF-β1刺激导致的EMT有关。而我们的研究也表明高浓度的草酸可激活TGF-β1，进而促进肾小管上皮细胞发生EMT。

西红花苷作为番红花主要生物活性组成部分，许多研究已经证实其具有抗凋亡、抗氧化的作用[15]。具有抗氧化自由基作用的SOD能够抑制脂质过氧化反应，从而减弱氧化应激对细胞的损伤。此外MDA作为脂质过氧化反应的指标，可以反映细胞氧化损伤的程度[16]。图3可见西红花苷缓解了草酸干预引起的MDA增加和SOD的减弱。该结果和流式ROS检测相一致，均可以证明西红花苷抑制草酸引起的应激损伤。故实验结果可以证实西红花苷可降低草酸干预造成的氧化应激损伤，并且可通过抗氧化作用抑制TGF-β1的表达，进一步抑制草酸引起的肾小管上皮细胞的EMT。

NF-κB是炎性反应中的重要信号转录因子，具有调节免疫和分化的功能[17]。当细胞处于正常生理状态时，NF-κB主要表达在细胞质上，并且被IκB阻止其功能。但当细胞被细胞因子、病毒、氧化应激等刺激后NF-κB被激活并转入细胞核内发挥调节基因转录的作用[18]。既往很多研究证实NF-κB与细胞很多信号转导有关，并在肾间质纤维化过程中发挥重要作用[19]。NF-κB广泛表达于肾小球和肾小管上皮细胞。草酸激活后的NF-κB能调节炎性反应，上调各种炎性因子的表达，最终促使肾小管上皮细胞的EMT[20]。因此我们检测西红花苷是否能通过抑制NF-κB通路拮抗草酸引起的肾小管细胞炎性反应。我们的研究证实与草酸组相比，NF-κB表达量在草酸组会增加。所以西红花苷抑制了NF-κB的表达，抑制了EMT的发生。

本研究从细胞实验层面初步证实了西红花苷可以通过TGF-β1、NF-κB通路抑制草酸引起的肾小管细胞EMT，为其在草酸钙肾结石的防治中提供了新的思路。但西红花苷在动物模型中是否会有同样的作用需要我们进一步研究。