高效液相色谱法同时测定兽用制剂中氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬的含量

张 璐，马秋冉，董玲玲，赵富华，杨 星，于晓辉

(中国兽医药品监察所，北京100081)

外耳炎是一种犬猫耳道常见疾病，患病动物的耳部皮肤会出现红斑、脱皮、疼痛和瘙痒症状，犬的发病率在5%～20%之间[1]。近年来有研究表明，氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬三种成分的复方兽药制剂可用于治疗犬的外耳炎。但目前多采用高效液相色谱法分别对氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬的含量进行测定，尚未见有同时测定三种成分的研究报道。本文拟建立高效液相色谱法同时测定兽用制剂中氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬的含量，以期为兽用制剂的开发提供研究基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Waters 2695高效液相色谱仪，配置Waters 2489双通道紫外检测器，Empower色谱工作站软件；电子分析天平：感量0.00001 g；KQ3200型超声波清洗器；三乙胺，色谱纯，Fisher公司；甲醇，色谱纯，默克公司；水由实验室MILLIPORE超纯水仪自制。

1.2 试药 氟苯尼考对照品(批号 K0301305)，购自中国兽医药品监察所；糠酸莫米松对照品(批号 510022-201301)、盐酸特比萘芬对照品(批号 100503-201402)，均购自中国食品药品检定研究院。糠酸莫米松原料药(批号 20140510)，盐酸特比萘芬原料药(批号 140301TH)，均购自武汉那拉白医药化工有限公司。兽用制剂为实验室自制，制备过程为：将氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬溶解于适宜辅料后，加纯水至37.5 mL，即得。制剂中氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬的浓度分别为15 mg/mL、2 mg/mL、15 mg/mL。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-0.02%三乙胺水溶液(75 ∶25)为流动相进行等度洗脱，流速为1.0 mL/min，以224 nm作为氟苯尼考及盐酸特比萘芬的检测波长、以250nm作为糠酸莫米松的检测波长，柱温为30 ℃，进样10 μL检测。在上述色谱条件下，氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬峰的理论塔板数均大于5000，分离度均大于1.5。

2.2 混合对照品溶液的配制 精密称取对照品氟苯尼考9.91 mg，糠酸莫米松19.95 mg、盐酸特比萘芬10.02 mg，分别置10 mL、25 mL、10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取氟苯尼考溶液5.0 mL、糠酸莫米松溶液2.0 mL、盐酸特比萘芬溶液5.0 mL分别置于100 mL、200 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得各对照品稀释液。从三种对照品稀释液中精密吸取适量于10 mL容量瓶中，配制成不同浓度的混合对照品溶液，用于含量测定。

2.3 供试品溶液的配制 精密吸取自制制剂2.0 mL，置200 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀。再精密吸取5.0 mL置50 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 阴性供试品溶液的配制 取各辅料，除不添加氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬原料药外，其他操作同自制制剂。配制完成后摇匀，精密吸取2.0 mL置200 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀。再精密吸取5.0 mL置50 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 专属性试验 分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μL，照“2.1”项下色谱条件测定，氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬与相应的对照品的色谱峰保留时间一致，达到基线分离，此时混合对照品溶液中，三种成分的浓度分别为14.76 μg/mL、3.18 μg/mL、15.00 μg/mL。阴性样品色谱中与氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬峰相应的保留时间处无吸收峰，表明制剂中其他成分对测定无干扰。见图1。

1.氟苯尼考；2.糠酸莫米松；3.盐酸特比萘芬A.混合对照品溶液(224 nm检测)；B.混合对照品溶液(250 nm检测)；C.阴性样品溶液(224 nm检测)；D.阴性样品溶液(250 nm检测)；E.供试品溶液(224 nm检测)；F.供试品溶液(250 nm检测)1.Florfenicol；2.Mometasone furoate；3.Terbinafine hydrochloride1.Mixed reference solution(224 nm);B.Mixed reference solution(250 nm)；C.Negative sample solution(224 nm);D.Negative sample solution(250 nm);E.Test solution(224 nm);F.Test solution(250 nm)图1 高效液相色谱图Fig 1 The High performance liquid chromatogram

2.6 标准曲线 将“2.2”项下混合对照品溶液照“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，测定。以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，分别绘制标准曲线，得氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬回归方程(n=8)：Y=22754244.64X+1239.20，r=1.000；Y=28139914.58X-1198.81，r=1.000；Y=149172957.70X-17145.80，r=1.000。结果表明，氟苯尼考质量浓度在0.49～49.20 μg/mL，糠酸莫米松在0.24～7.96 μg/mL、盐酸特比萘芬在0.25～50.00 μg/mL范围内，峰面积与溶液浓度线性关系良好。

2.7 重复性试验 取自制制剂样品，照“2.3”项下方法配制6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算含量。结果氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬平均含量分别为15.46 mg/mL、2.07 mg/mL、15.35 mg/mL，RSD分别为0.64%、0.75%、0.63%，表明方法重复性良好。

2.8 精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积并计算RSD值。氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘的RSD分别为0.75%、0.63%、0.68%，表明方法精密度良好。

2.9 稳定性试验 取“2.3”项下的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h各进样10 μL，测定氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬的峰面积，其RSD分别为0.36%、0.70%和0.40%，表明供试品溶液稳定。

2.10 定量限与检出限 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液进行逐步稀释，取稀释后溶液进样检测。按照10倍噪音计算最低定量限浓度，氟苯尼考、糠酸莫米松和盐酸特比萘芬的最低定量限浓度分别为：0.49 μg/mL、0.24 μg/mL、0.20 μg/mL；按照3倍噪音计算最低检出限浓度，氟苯尼考、糠酸莫米松和盐酸特比萘芬的最低检出限浓度分别为：0.25 μg/mL、0.16 μg/mL、0.13 μg/mL。

2.11 回收率试验 自制制剂中氟苯尼考原料药的量为562.5 mg、糠酸莫米松原料药的量为75 mg、盐酸特比萘芬原料药的量为562.5 mg。分别按照三个添加量添加原料药，氟苯尼考添加量为450、562.5、675 mg，糠酸莫米松添加量为60、75、90 mg，盐酸特比萘芬添加量为450、562.5、675 mg，每个添加量平行三份，照“2.3”项下制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，计算加标回收率(表1)。其中，氟苯尼考的回收率在99.06%～103.68%之间，平均回收率为100.80%，RSD值为1.89%；糠酸莫米松的回收率在101.53%～104.94%之间，平均回收率为102.83%，RSD值为1.17%；盐酸特比萘芬的回收率在99.84%～103.54%之间，平均回收率为101.37%，RSD值为1.59%。上述试验结果表明该方法回收率高。

3 讨论与小结

3.1 流动相的确定 本试验曾参照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)一部中收录的氟苯尼考含量测定方法[2]、国家食品药品监督管理总局发布的国家药品标准糠酸莫米松(征求意见稿)中收录的糠酸莫米松含量测定方法[3]及《中华人民共和国药典》(2015年版)二部中收录的盐酸特比萘芬含量测定方法[4]同时测定兽用制剂中氟苯尼考、糠酸莫米松、盐酸特比萘芬的含量，以便测定方法的推广和应用。试验中发现，三种方法均无法同时测定三种成分的含量。氟苯尼考含量测定方法的流动相为乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3)，以流动相为溶剂溶解样品。糠酸莫米松在该溶剂中溶解度极低，进样后无响应；盐酸特比萘芬峰的保留时间长于45 min，且峰形不佳。盐酸特比萘芬含量测定方法为：以三乙胺缓冲液(0.2%三乙胺溶液，用冰醋酸调节pH值至7.5)-甲醇-乙腈(30∶42∶28)为流动相A，以三乙胺缓冲液-甲醇-乙腈(5∶57∶38)为流动相B，进行梯度洗脱，梯度时间为38 min，以乙腈-水(1∶1)为溶剂溶解样品。流动相配制过程复杂，色谱图中氟苯尼考峰形不佳，糠酸莫米松无响应，盐酸特比萘芬出峰正常，但保留时间较长。糠酸莫米松含量测定方法的流动相是甲醇-水(65∶35)，以流动相为溶剂溶解样品。在该液相条件下，氟苯尼考峰会受到辅料的干扰，无法准确测定；盐酸特比萘芬峰保留时间长，且拖尾严重。为改善氟苯尼考与干扰峰的分离度，优化流动相比例为甲醇-水(75∶25)。为改善盐酸特比萘芬峰形，在水相中加入少量三乙胺。试验中发现不同浓度的三乙胺水溶液(0.004%、0.008%、0.02%、0.04%)对三种成分保留时间、分离度、拖尾因子、理论塔板数影响不大。考虑到三乙胺为易挥发性液体，为避免流动相配制过程中由于三乙胺挥发而造成试验结果不稳定，最终选择0.02%三乙胺水溶液为本试验的水相。故本试验采用“2.1”项下色谱条件分析。

表1 回收率试验结果Tab 1 Sample recovery rate test results

3.2 色谱柱的确定 考察Thermo Hypersil GOLD C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters Symmetry®C8 (4.6 mm×75 mm，5 μm)等色谱柱对三种成分保留时间、分离度、拖尾因子、理论塔板数的影响。结果表明，在相同试验条件下，Agilent C18色谱柱对盐酸特比萘芬的保留时间为74.87 min，理论塔板数约为665，保留时间过长，理论塔板数过低；Agilent C8色谱柱对氟苯尼考的保留时间为1.65 min，理论塔板数为958，保留时间较短，理论塔板数较低；Waters C8色谱柱对氟苯尼考的保留时间为0.94 min，保留时间过短。综合试验结果，Thermo Hypersil GOLD C8色谱柱对三种成分的保留时间分别为3.29 min、4.97 min、15.17 min，分离度分别为3.8、2.9、2.1，拖尾因子分别为1.2、1.1、1.1，理论塔板数分别为6384、9306、15002，故选择Thermo Hypersil GOLD C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)为试验用色谱柱。

3.3 色谱柱温度的确定 在含量测定过程中发现，糠酸莫米松的保留时间会随室温的变化而变化。为确保试验的重复性，应固定色谱柱温度。调节色谱柱温度为25、30、35 ℃，考察柱温对三种成分保留时间、分离度、拖尾因子、理论塔板数的影响。结果表明，三种试验温度下，这三种成分的色谱行为均良好。结合试验室室温变化，最终确定试验柱温为30 ℃。

本文建立的高效液相色谱法灵敏、简单易行，专属性、重复性、回收率均符合要求，能够同时测定兽用制剂中氟苯尼考、糠酸莫米松及盐酸特比萘芬的含量。