双响应值联合优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合γ-氨基丁酸富集技术研究

张良晨，李东红，于淼，刘晓晶

（1.辽宁省农业科学院食品与加工研究所，辽宁沈阳110161；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013；3.辽宁省疾病预防控制中心，辽宁沈阳110005）

糙米在发芽过程中由于内源酶的激活富集了一些对人体有特殊功效的功能因子，如六磷酸肌醇、谷维素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、阿魏酸、谷胱甘肽等，其中以GABA 最为引人关注[1]。GABA是一种非蛋白质类氨基酸，在各类生物体内均有分布[2]，它是生物三羧酸循环中支路反应的中间产物[3]。在植物体内GABA 的作用是调控植物的生长发育，保证碳源与氮源的稳定及信号的传递，在植物种子发芽过程中会成倍增加[4-6]。GABA 对于人体有着重要的生理作用，可以通过调节人体中枢神经系统，达到降低血压，舒缓血管的作用，医学临床试验已经证明，GABA 可以抑制肿瘤细胞中端粒酶的活性，从而控制肿瘤细胞增殖恶化，达到抗癌、抗肿瘤的功效[7]。研究发现，发芽糙米的GABA 的含量对比于糙米原料可以增长 2 倍～3 倍，是精白米的 10 倍[8]。

糙米原料带菌情况复杂，在发芽糙米生产过程中极易受到腐败微生物的侵染，使发芽糙米产品带上令人不愉快的气味。目前，主要采用的方抑菌方法是在糙米浸泡液中加入化学杀菌剂，在发芽糙米干燥前用大量的清水冲洗[9-10]，此种方法耗水量大、成本高、并且存在食品安全问题。脉冲强光杀菌技术起源于上世纪70年代，它利用瞬时、高强度的脉冲形式光能杀灭食品表面各类微生物[11]，它是一种物理杀菌方法，具有高效节能、易于实现机械化、自动化，无二次污染等优点，在食品领域已经应用于乳制品等包装的表面杀菌[12-13]。研究发现通过脉冲强光的照射能够大大增强植物种子中谷氨酸脱羧酶的活性[14]，谷氨酸脱羧酶是植物中催化谷氨酸生成GABA 的内源酶[15]，糙米中谷氨酸脱羧酶活性的增强能够大大增加发芽糙米GABA 的富集量，对比于未经脉冲强光照射的发芽糙米，其GABA 的富集量可增长30%以上[16]。因此将脉冲强光杀菌技术应用于发芽糙米生产中不仅能够杀灭污染发芽糙米的腐败微生物，而且能够达到富集GABA 的目的。本研究在单因素试验的基础上，以脉冲强光光照强度、照射次数、照射距离为响应因素，以发芽糙米灭菌率、GABA 富集量为响应值，采用响应面双响应值联合分析法探讨发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集技术，以期为脉冲强光技术应用于发芽糙米生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

糙米：盐丰 47（GABA 含量为 46.07 mg/100 g），中稻股份有限公司。

1.2 试验试剂

GABA 标准品：Sigma 公司；营养培养基：上海博微生物科技有限公司；次氯酸钠、重蒸苯酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硼砂、无水乙醇均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验设备

BSA124S 电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；QC200 恒温水浴锅、80-1 型离心机：江苏省金坛市医疗仪器厂；UV1200 型紫外可见分光光度计：上海正慧工贸有限公司；WI6086 型打浆机：西仪科技有限公司；XMT-152A 型电烘箱：温州龙兴机械厂；LDZX-30FA型灭菌锅：苏州奇乐电子科技有限公司；SW-CJ-lF 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 发芽糙米的制备

参考袁建等[17]的方法，并加以改进。浸泡温度30℃，浸泡液pH5.5，浸泡时间12 h，发芽温度32 ℃，发芽时间24 h。

1.4.2 发芽糙米脉冲强光处理

发芽糙米受腐败微生物侵染主要发生在糙米浸泡阶段[18]，在糙米浸泡吸水饱和后进行脉冲强光处理。

1.4.3 糙米发芽微生物测定

采用范军等[19]的方法。

1.4.4 GABA 含量测定

糙米浸泡后进行脉冲强光处理，按1.4.1 方法发芽后测定GABA 含量，测定方法采用蒋静等[20]的方法。

1.4.5 发芽糙米GABA 富集量计算

发芽糙米GABA 富集量=发芽糙米GABA 含量-糙米原料GABA 含量。

1.4.6 单因素试验

以脉冲强光对发芽糙米的灭菌率以及通过脉冲强光处理后发芽糙米的GABA 富集量为考察目标，以脉冲强光的光照强度、照射次数、照射距离为自变量进行单因素试验，考察脉冲强光各因素对于发芽糙米的灭菌率与GABA 富集效果。光照强度设定0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 kJ，照射次数设定 200、250、300、350、400、450 次，照射距离设定 8、9、10、11、12、13 cm。

1.4.7 响应面双响应值联合优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA富集工艺

在单因素试验的基础上以灭菌率、GABA 富集量为响应值，进行响应面试验，因素水平见表1。

表1 响应面试验水平因素表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.4.8 数据分析

采用Design-Expert 8.0.6 数据分析软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 脉冲强光处理单因素试验

2.1.1 光照强度对发芽糙米灭菌率及GABA 富集量的影响

脉冲强光光照强度对发芽糙米灭菌率与GABA富集量的影响见图1。

图1 脉冲强光光照强度对发芽糙米灭菌率与GABA 富集量的影响Fig.1 The effects of irradiation intensity of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由图1 可知，随着光照强度的增加发芽糙米灭菌率逐步增高，当光照强度达到0.4 kJ 时，其对应的灭菌率显著升高（p＜0.05），光照强度达到0.45 kJ 时灭菌率达到最大值90.41%，光照强度进一步增强其灭菌率趋于稳定，光照强度为0.50 kJ 与0.55 kJ 时所对应的发芽糙米灭菌率变化不显著（p＞0.05）。造成这种现象的原因是脉冲强光作为一种光波物理杀菌技术对于物体的穿透性较差[21]，过低的照射能量不能有效穿透微生物的细胞膜，无法破坏微生物细胞内溶物，因此达不到理想的杀菌效果。经过不同光照强度脉冲强光处理后的糙米发芽后GABA 富集量呈上升趋势，其增加幅度呈先增加后小幅度降低的趋势，光照强度达到0.40 kJ 时，发芽结束后其GABA 富集量显著增长（p＜0.05），其原因是照射能量过高对糙米中谷氨酸脱羧酶的活性有一定的抑制作用，导致GABA 富集量减少[22-23]。

2.1.2 照射次数对发芽糙米灭菌率及GABA 富集量的影响

照射次数对发芽糙米灭菌率及GABA 富集量的影响见图2。

图2 脉冲强光照射次数对发芽糙米灭菌率与GABA 富集量的影响Fig.2 The effects of irradiation frequency of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由图2 可知，当照射次数超过300 次时，发芽糙米灭菌率增加明显（p＜0.05），当照射次数为 350、400、450次时，其灭菌率没有明显的变化。脉冲强光光照次数的增加能够使发芽GABA 富集量稳步增加，当照射次数超过350 次后，相应的发芽糙米GABA 富集量增涨显著（p＜0.05）。以上试验结果说明当脉冲强光照射达到一定次数后对糙米的灭菌率提升有限，单纯的增加脉冲强光照射次数并不能增强其灭菌效果，但脉冲强光照射次数与发芽糙米GABA 富集量之间存在着一定的正相关。

2.1.3 照射距离对发芽糙米灭菌率及GABA 富集量的影响

照射距离对发芽糙米灭菌率及GABA 富集量的影响见图3。

图3 脉冲强光照射距离对发芽糙米灭菌率与GABA 含量的影响Fig.3 The effects of irradiation distance of pulsed light on sterilization rate and enrichment of GABA of germinated brown rice

由图3 可知，随着照射距离的增加，糙米灭菌率呈先增加再降低的趋势，当照射距离为9 cm 时其灭菌率最高，达到89.02%，照射距离超过10 cm 后其灭菌率明显下降（p＜0.05）。在一定的范围内，照射距离的增加能够扩大杀菌范围，从而提高灭菌效果，但是照射距离的增加会造成照射能量的衰减，在超过一定照射距离后，脉冲强光能量衰减到一定程度对微生物细胞壁的穿透效果有限造成了灭菌率的降低。当照射距离超过11 cm 后发芽后的糙米GABA 富集量明显降低（p＜0.05），造成这一现象的原因与照射距离增加使脉冲强光能量衰减有关。

2.2 响应面双响应值联合优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集工艺

2.2.1 响应面试验结果与分析

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 组合设计，以发芽糙米灭菌率、GABA 富集量为响应值，以脉冲强光的光照强度、照射次数、照射距离为自变量因素，进行响应面双响应值联合试验，优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集工艺，应用Design-Expert 8.0.6 数据分析软件对影响因素进行编码组合，具体试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及其试验结果Table 2 Program and experimental results of response surface analysis

双响应值（灭菌率、GABA 富集量）所得回归方程为：

灭菌率R1=91.28-0.11A+0.12B-0.72C+0.93AB-0.13AC+0.24BC-0.64A2-2.08B2-1.46C2；

GABA 富集量 R2=125.85+0.18A-0.18B-0.16C-0.02AB-0.32AC+0.63BC-1.15A2-3.75B2-0.78C2。

两组回归方程方差分析见表3 和表4。

表3 发芽糙米脉冲强光灭菌率回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation for sterilization rate of germinated brown rice

续表3 发芽糙米脉冲强光灭菌率回归方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance for the regression equation for sterilization rate of germinated brown rice

表4 发芽糙米脉冲强光GABA 富集量回归方程方差分析表Table 4 Analysis of variance for the regression equation for enrichment of GABA of germinated brown rice

由表3、表4 可知，所设定的各因素对芽糙米脉冲强光灭菌率影响排序为A＞B＞C，即光照强度＞照射次数＞照射距离，三者对于芽糙米脉冲强光灭菌率影响均为极显著，交互项AB、AC 对芽糙米脉冲强光灭菌率影响均为极显著，其他项对芽糙米脉冲强光灭菌率均无显著影响。所设定的各因素对发芽糙米GABA 富集量影响排序为A＞B＞C，即光照强度＞照射次数＞照射距离，其中光照强度对发芽糙米GABA 富集量影响极为显著，照射次数对发芽糙米GABA 富集量影响显著，交互项AB 对发芽糙米GABA 富集量影响显著，其他项对发芽糙米GABA 富集量均无显著影响。发芽糙米脉冲强光灭菌率回归模型p 值为0.000 3，发芽糙米GABA 富集量回归模型p＜0.000 1，均达到及其显著水平，失拟项均不显著，说明了两组回归方程拟合度较好，在所选自变量范围内能够很好的分析响应值的变化，可以用于发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集工艺的理论值预测。

2.2.2 相关变量间的交互作用

响应面各因素交互作用对发芽糙米灭菌率的影响见图4。

图4 各因素交互作用对发芽糙米灭菌率的影响Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on sterilization rate

响应面各因素交互作用对发芽糙米GABA 富集量的影响见图5。

图5 各因素交互作用对发芽糙米GABA 富集量的影响Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on enrichment of GABA of germinated brown rice

由图4 可知，在本试验条件下脉冲强光对发芽糙米的灭菌率为86.74%～92.98%，光照强度、照射次数、照射距离3 因素交互作用在3D 曲面图上都存在极值，光照强度、照射次数二者的交互作用的极值最大，且曲面图投影的等高线更接近于椭圆形，说明光照强度、照射次数二者的交互作用对于脉冲强光灭菌率的影响更加显著，由图4 中a、c 两图可以看出极值点对应的照射距离均为9 cm，因此固定照射距离9 cm 可以缩小极值查找范围，可选择光照强度、照射次数二者的交互作用的等高线来展开接下来的分析。

由图5 可知，在本试验条件下发芽糙米GABA 富集量为123.07 mg/100 g～126.67 mg/100 g，各因素交互作用在3D 曲面图上都存在最大响应值，说明所选因素取值范围对应的试验结果接近极值，通过响应面分析能够很好的预测试验结果理论值。3 个3D 曲面图的侧面弧度显示，光照强度与照射次数，光照强度与照射距离的弧度较大，且投影等高线均为椭圆形，说明光照强度与照射次数的交互作用与光照强度与照射距离的交互作用对发芽糙米GABA 富集量有比较显著的影响，照射距离与照射次数交互作用对于发芽糙米GABA 富集量的影响不明显。由图5 中a、c 两图可以看出极值点对应的照射距离取值均为9 cm，联系上段分析结果可以确定光照强度与照射次数两因素对于两个响应面都有较强的影响，且二者的交互作用对于试验结果也有较强的显著性，因此可以将两因素对发芽糙米灭菌率、GABA 富集量的交互作用曲面图进行叠加，分析两因素对于发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集技术相关度的分析，缩小最优区域取值范围。

2.2.3 双响应值联合优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集工艺

发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集曲面叠加图见图6。

图6 发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集优化曲面叠加图Fig.6 Superposition graph of contour plots for sterilization coupling GABA enrichment by pulsed light treatment

由图6 中的曲面可知光照强度、照射次数与双响应值呈正相关，相关性系数为0.813，通过Design-Expert 8.0.6 数据分析软件预测双响应值的最优解，最后确定脉冲强光最佳工艺参数为：光照强度0.448 kJ，照射次数395 次，照射距离9.012 cm，在此条件下，发芽糙米脉冲强光灭菌率预测值为91.28%，GABA 富集量预测值为125.85 mg/100 g，为方便操作对预测最优参数进行修改，选择光照强度0.45 kJ，照射次数395 次，照射距离9.0 cm，作为发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集的最优工艺参数。

2.3 最优工艺参数验证试验

设定脉冲强光参数光照强度0.45 kJ，照射次数395 次，照射距离9.0 cm，进行验证试验。结果表明，在此条件下发芽糙灭菌率为91.15 %，GABA 含量为170.10 mg/100 g，GABA 富集量为 124.03 mg/100 g，分别达到了预测值的99.86%与98.55%，试验实测值与预测值接近，所得脉冲强光最优工艺参数可靠。

3 结论

以脉冲强光光照强度、照射次数、照射距离为响应因素，在单因素试验的基础上以灭菌率、GABA 富集量为响应值，采用响应面双响应值联合分析法优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合GABA 富集工艺，最后得出脉冲强光处理最优工艺为：照强度0.45 kJ，照射次数395 次，照射距离9.0 cm，在此条件下发芽糙米灭菌率为91.15%，发芽糙米γ-氨基丁酸含量为170.10 mg/100 g，γ-氨基丁酸富集量为124.03 mg/100 g。