蚕蛹多肽螯合钙的生物可及性研究

王思远，赵梓月，穆利霞，廖森泰，邹宇晓

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，农业农村部功能食品重点实验室，广东广州510610）

生物利用率是指进入人体后能够通过消化道吸收，最终到达血液或淋巴沮织内（即进入人体内循环）的物质占摄入总量的比例。生物可及性是指在胃肠道消化过程中，释放到胃肠液中的量与摄入总量的比例，表示物质能被人体吸收的相对量，也是人体可能吸收的最大量。因此，生物可及性研究是生物利用率研究的重要基础[1]。人体对钙的摄入主要来自膳食摄入，对钙的吸收以离子（Ca2+）形式或结合到一种可溶性的有机分子上，才能够穿过小肠上皮细胞被肠道吸收。人体摄入的钙经胃消化后，大部分处于可溶状态，但到达肠环境中，会有部分被沉淀尤其是同时摄入食物中含有植酸、草酸、单宁以及纤维等时，易形成不溶性的钙盐影响人体对钙的吸收[2]。所以，研究补钙制剂在人体胃肠道环境中钙的可溶性，即生物可及性，是非常有意义。

目前市面上的补钙产品主要有以碳酸钙为代表的无机钙和以葡萄糖酸钙、乳酸钙和柠檬酸钙等为代表的有机钙。多肽螯合钙稳定性好、生物利用度高，作为新一代补钙制剂越来越受到关注，应用前景广阔[3]。本团队前期开发了一种蚕蛹多肽螯合钙，可溶性好，含钙量高，本研究拟通过体外模拟胃肠道消化法，比较该蚕蛹多肽螯合钙与碳酸钙和葡萄糖酸钙的生物可级性，为其补钙制剂的开发提供技术支撑与理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DF－101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；CR22G Ⅲ型高速冷冻离心机：日本日立公司；ST85Best 真空冷冻干燥机：美国Millrock 公司。

1.2 材料

新鲜削丝蚕蛹：两广2 号，韶关翁源县真诚意蚕桑专业合作社；Alcalase 酶（4.3×106U/mg）、胰蛋白酶（2.5×106U/mg）、胃蛋白酶（3.0×105U/mg）：诺维信（中国）生物技术有限公司；石油醚、盐酸、硫化钠、柠檬酸钠、氢氧化钾、氯化钙、氯化钠、无水乙醇：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司；络黑T：分析纯，天津市天新精细化工开发中心；磷酸二氢钾：分析纯，广州化学试剂厂。

2 方法

2.1 蚕蛹多肽螯合钙的制备

蚕蛹→漂烫2 min→60 ℃烘干→粉碎过40 目筛→石油醚脱脂→加入Alcalase 酶酶解4 h→沸水中灭酶5 min→离心取上清液→按肽钙比3.4 ∶1（质量比）加入氯化钙，调节pH 10，73 ℃反应时间80 min→加入4 倍体积95%乙醇进行沉淀→离心后取沉淀→冷冻干燥后得蚕蛹多肽螯合钙样品。

2.2 钙含量测定

参照GB/T 5009.92-2016《食品安全国家标准食品中钙的测定》中的EDTA 滴定法。

2.3 体外模拟消化试验

2.3.1 模拟胃液和肠液配制

1）模拟胃液：将 0.2 g 氯化钠、0.32 g 胃蛋白酶加入到80 mL 蒸馏水中，调pH 值至1.2 后定容至100 mL容量瓶。

2）模拟肠液：将0.68 g 磷酸二氢钾加入到少量蒸馏水中震荡至完全溶解，而后加入70 mL 蒸馏水，调pH 值至7.5 后，加入1 g 胰蛋白酶，混合均匀再用0.2 mol/L 氢氧化钠调pH 值至7.5，用蒸馏水定容至100 mL 容量瓶。

2.3.2 体外模拟胃肠道消化试验

1）体外模拟胃环境消化试验

将装有胃液的离心管在37 ℃水浴锅中预热10 min，称取一定量碳酸钙、葡萄糖酸钙、蚕蛹多肽螯合钙使其钙含量为2 mg/mL 投入胃液中。在37 ℃恒温水浴振荡器中分别振荡 0、5、10、30、60、120 min 后取出于沸水中灭酶5 min，冷却后在10 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液置于消化管中，加入10 mL 混合酸（浓硝酸/高氯酸=4 ∶1，体积比），置于电热板上加热硝化至剩余2 mL～3 mL，取出冷却，测定钙含量。

钙释放率/%=上清液中钙含量/补钙制剂中钙含量×100

2）体外模拟肠道环境消化试验

将装有胃液的离心管在37 ℃水浴锅中预热10 min，称取一定量碳酸钙、葡萄糖酸钙、蚕蛹多肽结合钙使其钙含量为2 mg/mL 投入胃液中。在37 ℃恒温水浴振荡器中振荡120 min 充分消化后，调节pH 值至7.5 后加入肠液。分别在 0、5、10、30、60、120 min 取出于沸水中灭酶5 min，冷却后在10 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液置于消化管中，加入10 mL 混合酸（浓硝酸/高氯酸=4 ∶1，体积比），置于电热板上加热硝化至剩余2 mL～3 mL，取出冷却，测定钙含量。

可溶性钙比例/%=上清液中钙含量/补钙制剂中钙含量×100

2.3.3 草酸、植酸、膳食纤维共存的体外模拟消化试验

1）不同浓度共存组分对补钙制剂在胃肠中可溶性钙含量的影响

在胃液中分别加入不同浓度（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%，质量比）的草酸、植酸、膳食纤维，根据2.3.2 中1）的方法，在模拟胃环境中消化120 min，测定可溶性钙含量。

将上述胃液中消化好的样品，调节pH 值至7.5 后加入肠液，振荡120 min。根据2.3.2 中2）的方法消化后，测定钙含量。

2）草酸、植酸、膳食纤维存在下补钙制剂在胃肠环境中的稳定性

在胃液中加入1.0%草酸、植酸、膳食纤维，根据2.3.2 中1）的方法，检测共存组分影响下，补钙制剂在胃环境中不同时间的可溶性钙含量。

在胃液中加入1.0%草酸、植酸、膳食纤维，根据2.3.2 中2）的方法，检测共存组分影响下，补钙制剂在肠环境中不同时间的可溶性钙含量。

相对可溶性钙比例/%=共存组分影响下可溶性钙含量/未添加共存组分时的可溶性钙含量×100

3 结果与分析

3.1 3 种补钙制剂在模拟胃肠消化中的生物可及性

相同钙含量的CaCO3、葡萄糖酸钙和蚕蛹多肽螯合钙在模拟胃环境中可溶性钙的释放率随消化时间的变化情况如图1 所示。

图1 3 种补钙制剂在胃中的释放情况Fig.1 The solubility of calcium in simulated gastric digestion

随着时间的变化，3 种补钙制剂在胃酸作用下不断解离形成钙离子，且蚕蛹多肽螯合钙的释放速率相对较快。120 min 后，CaCO3的钙释放率仅为68.13%，而葡萄糖酸钙和蚕蛹多肽结合钙经胃部消化后钙释放率均可达到90%以上。

经胃消化后，3 种补钙制剂在模拟肠环境中可溶性钙的变化情况如图2 所示。

图2 3 种补钙制剂在肠中的溶解情况Fig.2 The solubility of calcium in simulated intestinal digestion

pH 值是影响钙吸收的重要环境因素。由于肠道呈碱性，进入肠道后，溶解的Ca2+立刻与OH-反应生成沉淀，3 种补钙制剂的可溶性钙比例瞬间降到25 %以下，且随着时间变化，生成的沉淀越来越多，可溶性钙含量不断下降。碳酸钙作为一种无机钙盐，稳定性最差，120 min 后，CaCO3和葡萄糖酸钙的可溶性钙比例只有10%左右，可被吸收的钙离子含量较低，而蚕蛹多肽螯合钙的可溶性钙含量为15.5%，高于前面两者。

钙能被吸收的前提条件是其在肠道中处于可溶状态（即生物可及性），因此，稳定性是补钙制剂的重要指标。目前市售的补钙产品，其有效成分多为碳酸钙、乳酸钙或葡萄糖酸钙，虽然含钙量较高，但溶解度小，吸收利用不良，生物利用率低[4]。多肽螯合钙是钙离子与多肽结合形成的具有环状结构的络合物，可以通过减少不溶性钙化合物的形成来提高钙的转运[5]，同时，钙离子可以螯合物的形式被完整地转运吸收并有效释放[6]。

3.2 共存组分对3种补钙制剂生物可及性的影响

机体生长发育过程中，膳食中的钙在婴儿和儿童骨骼生长发育时吸收最好，吸收率可达70%左右，随着年龄的增长，钙的吸收率逐渐下降，中年以后仅有30%左右[7]。影响钙吸收的因素除机体状态、饮食习惯、生活方式、肠道pH 值外，还受多种食物成分的影响[8]。膳食成分中的某些营养素经胃肠道消化后在小肠内与钙结合，会抑制钙的吸收，如草酸、植酸、膳食纤维以及长链脂肪酸等[9]。

3.2.1 草酸对3 种补钙制剂生物可及性的影响

草酸普遍存在于植物中，如菠菜、芋头、甘薯等均具有较高的草酸含量，已知草酸会通过形成钙的不溶性盐来干扰钙的吸收，浓度过高甚至会导致肾结石的发生。以3 种补钙制剂在胃肠消化中可溶性钙含量为基准，研究添加不同浓度草酸时的相对可溶性钙含量，结果如图3 所示。

图3 不同浓度草酸对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙的影响Fig.3 Effect of different oxalic acid on the solubility of calcium in simulated gastronintestinal digestion

在胃肠环境中，草酸对CaCO3、葡萄糖酸钙、蚕蛹多肽螯合钙的溶解性均有影响。随着草酸浓度的不断增大，3 种补钙制剂经胃消化后的相对可溶性钙比例均有所降低，其中，受影响最大的是葡萄糖酸钙，当草酸浓度达到2.5%时，葡萄糖酸钙的相对可溶性钙含量仅为27.2%。经肠消化后，CaCO3的相对可溶性钙含量仅为17.2%，葡萄糖酸钙和蚕蛹多肽螯合钙的相对钙含量分别为33.3%和37.6%。

进一步研究添加1.0%草酸时，3 种补钙制剂在胃肠消化过程中相对可溶性钙比例的变化情况，结果如图4 所示。

图4 草酸对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙含量变化的影响Fig.4 Effect of oxalic acid on the changes of soluble calcium in simulated gastronintestinal digestion

添加草酸后，CaCO3、葡萄糖酸钙在胃消化过程中的可溶性钙含量均明显下降，消化120 min 后，CaCO3和葡萄糖酸钙在胃中的含量为未添加时的55%左右，但蚕蛹多肽螯合钙受影响较小，可保持75%左右。在肠消化过程中，草酸共存时，3 种补钙制剂的相对可溶性钙比例下降趋势较缓慢，分别为73.2%、76.6%和82.5%，蚕蛹多肽螯合钙受影响相对较小。

3.2.2 植酸对3 种补钙制剂生物可及性的影响

3 种补钙制剂添加不同浓度植酸时的相对可溶性钙比例如图5 所示。

图5 不同浓度植酸对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙的影响Fig.5 Effect of different phytic acid on the solubility of calcium in simulated gastronintestinal digestion

植酸共存时，经胃消化和肠消化后，3 种补钙制剂的相对可溶性钙比例均明显下降，但下降幅度小于草酸。消化120 min 后，CaCO3、葡萄糖酸钙和蚕蛹多肽螯合钙的相对可溶性钙比例分别为55.5 %、47.6 %和65.7%。肠消化后，三者的相对可溶性钙比例分别为36.7%、54.8%和50.0%。

3 种补钙制剂在胃肠消化过程中相对可溶性钙比例的变化情况，结果如图6 所示。

由图6 可看出，添加1.0%植酸时，在胃环境中，蚕蛹多肽螯合钙受影响最小，CaCO3和葡萄糖酸钙受影响的程度差不多；肠环境中，3 种补钙制剂间差异较小。

图6 植酸对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙含量变化的影响Fig.6 Effect of phytic acid on the changes of soluble calcium in simulated gastronintestinal digestion

植酸普遍存在于豆类、谷类等植物中，具有很强的螯合能力，能够与食物中金属离子结合形成不溶性植酸盐，植酸盐是肌醇的六磷酸盐并且可以与钙结合，使它们在体内难以吸收[10]。Frontela 等通过添加外源植酸酶，利用Caco-2 细胞模型研究了婴儿谷物食品中矿物质的生物有效性，研究结果表明，添加外源植酸酶去除植酸后，谷物中的钙在细胞水平上的吸收显著增加[11]。

3.2.3 膳食纤维对3 种补钙制剂生物可及性的影响

膳食纤维含量较高的谷物产品也会影响矿物元素的可利用性。不同浓度膳食纤维对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙的影响结果见图7。

图7 不同浓度膳食纤维对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙的影响Fig.7 Effect of different dietary fiber on the solubility of calcium in simulated gastronintestinal digestion

由图7 可以看出，膳食纤维浓度对和葡萄糖酸钙和蚕蛹多肽螯合钙在胃肠消化中的影响较小，添加膳食纤维后，两者的相对可溶性钙比例均能80%以上，且受浓度影响小。但添加膳食比例后，CaCO3的可溶性钙明显下降，尤其是在肠消化过程中，当膳食纤维浓度为2.5%时，CaCO3的可溶性钙比例仅为36.7%。

膳食纤维对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙含量变化的影响结果见图8。

图8 膳食纤维对3 种补钙制剂在胃肠中可溶性钙含量变化的影响Fig.8 Effect of dietary fiber on the changes of soluble calcium in simulated gastronintestinal digestion

从图8 可以看出，添加1.0%膳食纤维时，3 种补钙制剂在胃肠道环境中可溶性钙含量变化较小，均能保持80%以上。摄入膳食纤维含量较高的谷物产品也会影响人体对矿物元素的吸收利用，主要是膳食纤维中的糖醛酸残基可以在胃肠道内电离成负电性，以静电离子键或配位键与钙离子结合成络合物，从而影响钙的吸收[12]。

4 结论

碳酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙等离子钙的缺点是在基础肠道环境中容易形成钙沉淀，导致膳食钙的吸收和生物利用度严重降低。此外，过量摄入碳酸钙可能导致胃肠道副作用，包括便秘、产生气体、肠胃气胀和腹胀。螯合钙作为离子钙的优选替代物，被认为克服了离子钙的两个主要局限，即低浓度的低吸收和低生物利用度，以及高水平的生物毒性。肽钙螯合物在消化过程pH 值变化中可保持溶解并且是电中性的，其可在肠道内通过特定通道直接被吸收，吸收速度快且吸收量大，是作为增加人体胃肠道钙吸收补充剂的合适候选物[13]。近年来，国内外学者致力于寻找高效、低成本的多肽材料，已从多种食品蛋白中制备出金属螯合肽，如鱼骨、南极磷虾、太平洋鳕鱼等[14-16]，并发现这些肽类在改善钙等二价矿物元素生物利用度方面具有极大的潜力。

本文以CaCO3、葡萄糖酸钙为对照，探究蚕蛹多肽螯合钙在胃肠道环境中的生物可及性。在模拟胃消化环境中，蚕蛹多肽结合钙的钙释放量达90%以上，在肠道环境中，其可溶性钙含量显著高于CaCO3、葡萄糖酸钙；在食物共存成分草酸、植酸、膳食纤维的影响下，蚕蛹多肽螯合钙仍具有较好的稳定性，是理想的钙补充剂材料。