一个木聚糖降解菌群的分离及木聚糖酶酶学性质分析

姚 健,毕文慧,桂 伦,马吉平 ,沈爱喜

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.江西省农业科学院 植物保护研究所，江西 南昌 330200;3.山东农业工程学院 食品科学与工程学院，山东 济南 250100))

我国是一个农业生产大国，每年都会产生大量的农业副产物和下脚料，如稻壳、秸秆、麦麸和玉米芯等。由于缺乏有效合理的处理方式，在农业生产过程中仍采用焚烧的方法处理这些农业废弃物，不仅浪费资源，还造成环境污染、病虫害传播。在能源短缺、环境污染严重的环境下，如何有效利用这部分生物资源成为急需解决的一大问题。半纤维素作为植物细胞壁的主要成分，是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体(包括木糖、阿拉伯糖和半乳糖等)，其含量仅次于纤维素，约占植物干重的35%，主要组成部分为木聚糖。木聚糖是一种由β-1，4-糖苷键连接而成的木糖聚合物，完全降解需要多种酶的共同参与，包括β-1，4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶。其中β-1，4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是木聚糖降解过程中的关键酶。木聚糖酶降解木聚糖产生的低聚木糖在饲料工业及畜牧业中具有广泛的应用价值，可提高饲料的利用率，促进动物肠道内双歧杆菌的定殖，增强免疫力，增进动物健康，还能改善动物肠道微生物的生态平衡，减少粪便中腐败物物质的产生，降低环境污染[1-3]。目前，低聚木糖主要来源于木聚糖的降解，若能有效利用木聚糖酶降解玉米芯等农林废料生产低聚木糖，将对资源利用、环境保护以及经济效益的提高具有重大意义。另外，木聚糖酶在食品[4]、造纸[6-9]、纺织等行业也都起到了重要作用。木聚糖酶在自然界中分布广泛，国内外研究人员已经从细菌[10-14]、真菌[15-19]、植物以及无脊椎动物中分离到了木聚糖酶。目前，有关木聚糖酶生产的研究集中于单一菌株，而以复合菌株生产木聚糖酶的研究较少。利用单一菌的木聚糖酶发酵液处理玉米芯生产低聚木糖时，需预先经碱处理玉米芯提取木聚糖，而本研究筛选到的木聚糖酶降解菌群利用玉米芯生产低聚木糖时，不需预先碱处理可以直接降解玉米芯粉生产低聚木糖(主要以木三糖和木四糖为主)，对减轻低聚木糖工业化生产过程中设备生产压力以及环境污染都有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 获取微生物菌群的样品来源于堆置发酵时间为3 d，发酵温度为40 ℃的猪粪与甘蔗叶混合堆肥(初始C/N比为25∶1，含水率为60%，初始pH为8.0)20 g。

1.1.2 培养基 ①富集培养基I：称取样品20 g，加入200 mL ddH2O，加入玻璃珠10 g，100 r/min震荡过夜，8 000 r/min离心10 min，取上清，过滤除菌作为富集培养基；②富集培养基II(g/L)：NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，FeSO40.01，木聚糖 10，定容至1 L，115 ℃灭菌25 min；③产酶培养基(g/L)：NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，FeSO40.01，玉米芯4.0(60目过筛)，定容至1 L，121 ℃灭菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖降解微生物菌群的制备 称取堆肥样品5 g，接种至100 mL富集培养基I中，30 ℃，160 r/min震荡培养3 d；取5 mL培养液接种至富集培养基II中，相同条件下继续培养4 d；再从中取5 mL培养液转接至新鲜富集培养基II中，相同条件下继续培养4 d，如此反复培养6次，获得含木聚糖降解微生物菌群的培养液。同时取10 mL培养液测木聚糖酶活性。

1.2.2 微生物菌群的结构鉴定 利用细菌提取试剂盒提取基因组，16S rRNA-v4区基因PCR扩增：50 μL体系，25 μL PrimerSTAR Max DNA 聚合酶(2×)，1 μL模板，引物F (5′-AAATTTTTTTTCCCCCCCGG-3′)和R (3′-GGGCCCCCTTTAAAAA-AAAAC-5′)各1 μL，22 μL ddH2O；反应程序：98 ℃ 4 min，98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，PCR产物送华大基因测序。

1.2.3 木聚糖酶酶活性测定 木聚糖酶酶活性检测采用Megazyme试剂盒说明书进行，具体方法如下：取200 μL发酵液，加入100 μL 1% AZO-xylan (Birchwood)，55 ℃水浴2 min，8 000 r/min离心5 min，加入500 μL 95%的乙醇，混匀后室温放置5 min，取上清于590 nm测定光吸收值。以100 ℃处理10 min的粗酶液作为阴性对照，每个样品设置3个平行。本研究中木聚糖酶酶活性测定均采用该方法。将1个酶活单位定义为从阿拉伯木聚糖中释放1 μmol D-木糖所用的酶量。

1.2.4 菌群生产木聚糖酶发酵条件的优化 取1.2.1制备的新鲜培养液1 mL，接种至20 mL无菌富集培养基II中，40 ℃，160 r/min培养过夜，作为制备木聚糖酶发酵液的种子液。①不同玉米芯浓度的优化：取玉米芯浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%和0.8%，调节培养基的pH至9.0，40 ℃、160 r/min 震荡培养4 d，测木聚糖酶活性；②不同培养温度优化：选取25、30、35、40和45 ℃分别作为菌体的培养温度，160 r/min 震荡培养4 d，测木聚糖酶活性；③不同初始pH的优化：选取pH 6.0、7.0、8.0、9.0和10.0分别作为菌体培养的初始pH，40 ℃、160 r/min震荡培养4 d，测木聚糖酶活性；④不同培养时间的优化：在最佳温度、初始pH和玉米芯浓度的基础上，在菌体培养的过程中每隔24 h取样，共取样3次，测木聚糖酶活性。

1.2.5 菌群发酵液中木聚糖酶酶学性质分析 ①最适反应温度：在反应温度为20～70 ℃的条件下测定其酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100%)；②最适反应pH：调整发酵液pH值分别为pH 6.0～8.0 (100 mmol/L磷酸盐缓冲液)、pH 7.5～9.0 (100 mmol/L Tris-HCl 缓冲液)、pH 8.5～10.0 (100 mmol/L glycine-NaOH 缓冲液)，在最适反应温度下测定粗酶液的木聚糖酶活性(以酶活力最高时记为100%)；③温度稳定性：将发酵液分别在30、35、40、45、50、55、60、65和75 ℃条件下保温2 h，在最适反应温度及pH条件下测定剩余酶活性，得到酶的热稳定性，以4 ℃条件下保存酶液的酶活性定义为100%；④pH稳定性：将发酵液分别在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的条件下保温0.5 h，在最适反应温度及pH条件下测定剩余酶活性，得到酶的pH稳定性，以4 ℃条件下保存酶液的酶活性定义为100%；⑤SDS-PAGE电泳及酶谱分析：SDS-PAGE电泳按照Laemmli[20]的方法进行，分离胶浓度12%，浓缩胶5%，电泳结束后采用考马斯亮蓝G250染色10 min，脱色。酶谱分析在分离胶中添加0.1%的玉米芯木聚糖，采用标准SDS-PAGE电泳，用25%的异丙醇溶液使蛋白复性，50 ℃条件下保温1 h，然后染色[21]；⑥微生物菌群发酵液水解玉米芯制备低聚木糖：取0.01 g粉碎的玉米芯粉，加入3 mL发酵液，55 ℃反应4 h，12 000 r/min离心10 min,取上清，采用薄层层析法检测上清液中的糖成分。展开剂：V正丁醇∶V乙酸∶V水=2∶1∶1，显色剂：V甲醇∶V浓硫酸=95∶5，烘烤显色。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶生产菌群的群落结构分析

对富集到的菌群进行16S rRNA-v4区分析发现(图1)，该菌群中未知无法分类的菌属约50.8%；已知可分类的菌属约占49.2%，主要由无色杆菌属、苍白杆菌属、原小单胞菌属、贪铜菌属、寡养食单胞菌属、金黄杆菌属、草螺菌属、细小杆菌属等组成，其中草螺菌属占24.9%、寡养食单胞菌属占11.1%，金黄杆菌属占5.6%。

2.2 菌群发酵产木聚糖酶的条件优化

温度、pH、碳源浓度及培养时间等发酵条件对菌种的生长、繁殖、代谢有着重要的影响，因此设置适宜的培养条件对微生物产酶量的提升起着关键作用。对碳源浓度、初始培养pH、培养温度及培养时间研究发现，玉米芯浓度为0.2%时，发酵液中木聚糖酶的酶活性最高；玉米芯浓度为0.8%时，发酵液中木聚糖酶的酶活性较低，为最高酶活性的96.3%，总体来说，玉米芯浓度在0.2%～0.8%范围内，对发酵产木聚糖酶的酶活性影响不大(图2A)。初始培养pH为9.0时，发酵液中木聚糖酶活性最高，初始pH在7.0～10.0之间时，培养pH对发酵液中木聚糖酶活性影响不大，酶活性均高于90%，随着pH的升高，酶活性迅速降低，为最高酶活性的50%左右(图2B)。此外，培养温度及时间对发酵液中木聚糖酶活性的影响研究发现，培养温度和时间分别在40 ℃和5 d时，发酵液中木聚糖酶的活性最高，其后随着温度的升高及培养时间的延长，其酶活性均迅速降低(图2C和2D)。

图1 富集样品在属分类水平上中的分析柱状图Fig.1 The profiling histogram of enriched samples at the genus classification level

2.3 菌群发酵液中木聚糖酶的酶学性质分析

2.3.1 发酵液中木聚糖酶的最适反应温度 在反应温度为20～70 ℃的条件下测定发酵液中木聚糖酶的酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100%)。如图3所示，在限定温度下，当温度低于55 ℃时，发酵液中木聚糖酶的酶活性随着温度的升高而升高；随着温度的升高，木聚糖酶活性逐渐降低；在最高反应温度70 ℃下，其酶活性为最高酶活性的87%左右。

图2 菌群发酵产木聚糖酶的条件优化Fig.2 Optimization of conditions for producing xylanase by bacteria consortium

图3 发酵液中木聚糖酶的最适反应温度Fig.3 Effect of temperature on the activity of xylanase

2.3.2 发酵液中木聚糖酶的最适反应pH 在反应温度55 ℃，pH为 6.0～10.0的条件下测定发酵液中木聚糖酶的酶活性，得到其最适反应pH(以酶活力最高时记为100%)。如图4所示，当pH低于8.0时，发酵液中木聚糖酶的酶活性随pH值的升高逐渐升高；由于在pH 8.5～10.0条件下测得的发酵液中木聚糖酶的酶活性均低于pH 8.0时的酶活性，因此在以AZO-xylan作为底物时，将pH 8.0定义为发酵液中木聚糖酶的最适反应pH。

图4 发酵液中木聚糖酶的最适反应pHFig.4 Effect of pH on the activity of xylanase

2.3.3 发酵液中木聚糖酶的温度稳定性 将发酵液分别在30、35、40、45、50、55、60、65和75 ℃条件下保温2 h，然后在55 ℃和pH 8.0条件下测发酵液中木聚糖酶的剩余酶活性(以4 ℃条件下保存酶液的酶活性定义为100%)。如图5所示，发酵液中的木聚糖酶在温度低于55 ℃条件下处理2 h，保持较高的温度稳定性，其酶活性没有明显的改变，其后随着温度的升高，其温度稳定性明显降低，60 ℃处理2 h后，剩余酶活性仅为原来的30%左右。

图5 发酵液中木聚糖酶的温度稳定性Fig.5 Effect of temperature on the stability of xylanase

2.3.4 发酵液中木聚糖酶的pH稳定性 将发酵液分别在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0条件下保温0.5 h，然后在55 ℃和pH 8.0条件下测发酵液中木聚糖酶的剩余酶活性(以4 ℃条件下保存酶液的酶活性定义为100%)。如图6所示，发酵液中木聚糖酶在pH 5.0～9.0之间处理0.5 h，能保持很好的pH稳定性，其酶活性没有明显的变化，其后随着pH的升高，其酶活性逐渐降低，但在pH 10.0时，仍保有较高的酶活性，为最高酶活性的95%左右。

图6 发酵液中木聚糖酶的pH稳定性Fig.6 Effect of pH on the stability of xylanase

2.3.5 SDS-PAGE电泳及酶谱分析 发酵液的SDS-PAGE及木聚糖酶酶谱结果如图7所示，该菌群可分泌的3种木聚糖酶，其分子质量大小分别约为200、45和40 kDa。

2.3.6 菌群发酵液中木聚糖酶降解玉米芯的产物分析 经木聚糖酶发酵液处理后的玉米芯粉，通过薄层层析分析发现，玉米芯粉可以被菌群发酵液中的木聚糖酶直接降解为低聚木糖(主要成分为木三糖和木四糖)(图8)，而不需经过碱预处理提取木聚糖。

图7 SDS-PAGE及酶谱分析Fig.7 SDS-PAGE and zymogram analysisM1：低分子质量标准蛋白；M2：高分子质量标准蛋白；1：木聚糖酶酶谱；2：活性蛋白电泳；3：非活性蛋白电泳M1：Protein marker (low)；M2：Protein marker(high)；1：Spectrum of xylanase enzyme；2：SDS-PAGE electrophoresis of active proteins；3：SDS-PAGE electrophoresis of denaturedproteins

图8 发酵液处理玉米芯粉薄层层析Fig.8 TLC analysis of corn kernel meal hydrolyzed by xylanaseM：木糖标准品；1：发酵液处理玉米芯4 h；2：发酵液处理玉米芯0 hM：xylooligosaccharide standards；1：The corn cob powder treated with fermentation liquor for 4 h；2：The corn cob powder treated with fermentation liquor for 0 h

3 讨 论

迄今为止，人们已经从环境中筛选到了许多产木聚糖酶的菌株。如张晓元等[22]从山东某造纸厂排水沟旁碱性土壤中筛选到1株产木聚糖酶的芽胞杆菌BacillussubtilisZH-07，可以利用从玉米芯中提取的木聚糖为惟一碳源产酶；王中月等[23]从土壤中筛选到1株细菌Paenibacillussp.39631，不仅可以利用从玉米芯中提取的木聚糖做为碳源，也可以直接利用玉米芯粉作为碳源产木聚糖酶。本研究通过分步富集培养的方法从猪粪与甘蔗叶混合堆肥中得到一组木聚糖酶生产菌群，该菌群中已知的微生物主要以草螺菌属、寡养食单胞菌属和金黄杆菌属为主；该菌群可以直接利用玉米芯粉作为碳源发酵产木聚糖酶，所产木聚糖酶的最适反应pH为8.0，与来源于Cladosporiumoxysporum的木聚糖酶相似[24]；最适反应温度为55 ℃，高于AspergillusfumigatusR1所产木聚糖酶的最适反应温度[25]。在低于55 ℃时，菌群发酵液中木聚糖酶保持较高的温度稳定性，处理2 h，其酶活性没有明显的变化，其稳定性明显高于来源于芽胞杆菌B695[26]。此外，发酵液中的木聚糖酶也保持较高的pH稳定性，pH 5.0～9.0之间处理0.5 h，能保持很好的pH稳定性，其酶活性没有明显的变化。李琦等[27]研究发现来源于嗜热网球菌的木聚糖酶可以水解碱法提取的玉米芯木聚糖制备低聚木糖，而本研究发现的菌群发酵液可以直接水解玉米芯粉制备低聚木糖(木三糖和木四糖为主)，省去了碱处理玉米芯制备木聚糖的步骤，从而降低了环境污染以及生产成本。