近红外光谱技术在食品微生物检测中的应用

◆作者：周冰谷花振新杨荣 林燕贞朱文亮

◆单位：1.精益和泰质量检测股份有限公司；2.广东恒兴饲料实业股份有限公司

据2006-2015年中国大陆地区食物中毒特征分析统计发现，“微生物性”食物中毒事件报导量以及导致食物中毒人数均位于首位。引起食物中毒的食品微生物多样，传统的微生物检测方法主要为生化检验，操作程序繁杂，检测周期长，易导致食品质量和安全监测滞后。较为先进的检测方法有质谱、核磁共振、基因芯片技术等，检测成本相对较高。近红外光谱技术具有无损、快速等优点，在化工、农业、医药、环境等领域发展极为迅速，它是目前世界上发展非常快速的分析技术之一，本文主要综述近红外光谱技术在食品微生物检测应用中的研究。

1 近红外光谱技术

1.1 基本原理及特点

近红外光谱区的波长范围在780～2526nm，近红外光谱是由分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生。近红外光谱技术利用O-H、N-H、C-H等含氢基团化学键伸缩振动的倍频及合频吸收近红外光特点，获得样本光谱中承载样本的物理、化学、生物学信息，通过将采集样本光谱和测量参比值结合化学计量方法，进行定标建模，实现对未知样本参数的预测。

1.2 近红外技术检测微生物的过程

微生物由核酸、蛋白质等化学成分组成，其成分对近红光进行作用吸收，提供不同特性的光谱。微生物定标样本的近红外光谱包含结构与组成等信息，其性质参数与其结构、组成具相关性。因此，样本的光谱与性质参数的测量值也一定具有相关性，应用化学计量学方法对其进行关联，确立两者之间的定量或定性关系，完成模型后，仅需采集待预测样本的近红外光谱，再利用已经建立的模型对待预测样本的组成或性质参数进行预测，即为定标建模和模型预测，如图1。

2 在食品检测中的应用

2.1 食品中产毒真菌及其毒素的检测

产毒真菌是指产生真菌毒素的真核细胞型微生物，其产生的毒素已经鉴定有400多种，不同的真菌毒素具有不同毒性，能损伤体细胞、致畸、致癌。近红外光谱技术可对食品中的产毒真菌进行有效预测监控，以降低经济损失，保证食品安全。

据联合国粮农组织调查估算，全球每年受真菌毒素的污染的粮食约有25%，因污染严重而失去商业价值的农作物约有2%。粮食品质保证还需科学贮藏和检验监控来护航，金昌福等（2016）应用近红外光谱技术建立稻谷表面霉菌的定标模型可描述和预测稻谷表面霉菌总数在贮藏仓内的变化规律。沈飞等（2018）建立的稻谷中的霉菌和菌落总数进行定标建模，模型可快速预测早期霉变稻谷中的菌落总数和鉴别感染不同霉菌及区分不同霉变程度的稻谷样本。

图1 近红外光谱分析技术过程示意图

果蔬的保鲜期常受到真菌影响。苹果较其他种类更易被扩展青霉污染，扩展青霉素易导致肝脏和肾脏损伤。张亮（2010）应用近红外技术检测建立苹果中扩展青霉及苹果汁中展青霉素的定标模型可进行定性和定量分析，能将苹果在扩展青霉及其他不同霉菌、不同程度污染下，有效区分出扩展青霉，检出限为：1.5×103个/mL；不同基质中展青霉素的检测限分别为：浓缩苹果汁中为9.76μg/L；鲜榨苹果汁中为 9.54μg/L；水溶液中为9.29μg/L。胡耀华等（2014）采用多元散射校正光谱预处理方法，通过多元线性回归，建立的鲜枣内酵母菌落总数的近红外光谱模型，并结合鲜枣的近红外光谱，建立了鲜枣光谱吸光度值与贮藏时间的动力学模型，可预测鲜枣在室温下的安全贮藏期。

花生是人们喜爱坚果，也是我国重要油料经济作物。但它容易受到黄曲霉污染，部分黄曲霉菌产生毒素，其中黄曲霉毒素B1是一种极强的肝毒素，可引起肝脏急性中毒和癌症。刘鹏等（2017）建立了五种黄曲霉产毒菌的定标模型，能快速检测受霉菌污染的花生。

保健食品具有抗疲劳、提高免疫力等功效以辅助人体健康。蝙蝠蛾拟青霉和安络小皮伞菌发酵菌粉中含多种类似虫草成分。逯城宇（2017）采用近红外光谱分析技术结合化学计量学方法，分别开展了它们中的虫草酸、多糖、腺苷和蛋白质含量同时快速检测方法研究，模型的预测性能较好。红曲菌也具有保健等价值，黄常毅（2014）采用氨基葡萄糖法测定生物量，应用遗传算法优选光谱波段并建立了预测红曲菌固态发酵生物量的定标模型，所建模型能够实现红曲菌固态发酵生物量的快速检测。

酵母在食品中的应用非常广泛，为保证酵母产品质量稳定需对其生产过程进行快速检测监控，王玮等（2017）利用Antaris域型傅里叶变换近红外光谱仪建立酵母菌定标建模,同时利用极限学习机（ELM）建立酵母菌生长过程4个阶段的分类模型，应用模型进行10次预测，其运行的训练集和测试集中的平均识别率分别为98.68%和97.37%。

2.2 食源性致病菌的检测

致病菌广泛存在我们的生活环境中。当人们食用被致病菌污染的食品时，人体可能会发生病变、中毒甚至突变、致癌等危害。国家相关标准对预包装食品常监控的致病菌有：单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌。

岳田利等（2010）应用傅里叶近红外光谱技术可准确判别大肠埃希氏菌等六种标准菌株。刘建学等（2018）采用傅里叶变换近红外光谱技术对未知样本中3种食源性致病菌（大肠埃希氏菌O157∶H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌）进行预测判别，正确率均达到100%。在检测方法探索过程中，也存在一些问题，马凯旋（2018）采用近红外光谱分析技术结合化学计量学方法对大肠埃希氏菌O157∶H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌以及这三种细菌混合培养作为第四类菌为研究对象，发现采集的致病菌近红外谱图受其浓度和培养时间影响较大，并干扰检测结果，为近一步提高近红外光谱技术在该领域的适用性提供了很好的参考作用。

近红外光谱技术已应用到牛奶中的致病菌检测，王建明等（2016）利用傅里叶变换近红外光谱技术采集被阪崎肠杆菌、金葡萄球菌、大肠杆菌三种致病菌污染的牛奶样本，结合多元散射校正对光谱进行预处理，并结合偏最小二乘判别分析建立的定标模型，预测性能理想。

2.3 致食品腐败的微生物检测

食品的可食期受环境和微生物的影响较大，特别是生鲜农产品等，具有易腐败、季节性和地域性的特点，产后贮藏保鲜以及冷链物流等技术水平不足，腐败变质情况严重。研究表明，生鲜食品在化学、内源酶及微生物作用下降低或失去营养和商品价值，由微生物引起的腐败变质是重要原因之一。

在掌握畜禽肉类货架期方面，快速无损检测方法凸显优势，熊来怡（2012）通过零级模式动力学模型及主成分分析提取猪肉在室温和冷藏温下贮藏时的近红外光谱特征值，分别建立菌落总数的动力学模型和其与近红外光谱间的动力学模型。从而可利用近红外光谱技术实现无损检测猪肉的细菌菌落总数并预测其贮藏期。张累蕾等（2013）将可见光谱与近红外光谱技术结合（400～1100 nm），对冷却肉中菌落总数和颜色进行定标建模，所建定标模型能准确检测冷却肉细菌总数。郭中华等（2014）将近红外高光谱图像技术和化学计量方法结合研究了冷鲜羊肉表面的细菌总数的近红外检测方法，发现径向基函数人工神经网模型预测效果最好。鸡肉加工过程中常受到盖氏假单胞菌等的污染，影响鸡肉品质，陈全胜等（2017）应用近红外技术对污染盖氏单胞菌的肌肉进行定标建模，其训练集和预测集的识率分别为99.17%和95.00%。

在水产品品质检测方面，段翠等（2014）以便携式近红外光谱仪为硬件，以牙鲆、鲈鱼、三文鱼为研究对象，将这三种分别各采集90组样本光谱，结合样本测量值进行定标建模，再用30组样本数据用于模型验证，20组实际样本数据用于性能验证，均取得良好效果。

鸡蛋内部品质在无损检测领域得到填补，赵楠等（2019）应用近红外光谱技术对鸡蛋内部污染程度的可视化研究，根据鸡蛋内部污染程度及光谱特性的差异，建立了鸡蛋内部污染程度伪彩色图像，采用支持向量机（SVM）结合样本中菌落总数的光谱信息进行定标建模，模型能较好预测鸡蛋中的菌落总数。

大肠菌群是评价食品质量卫生指标之一，刘建学等（2006）对原料乳中大肠菌群的测定原理与方法进行了研究，采用基于余弦相似度因子分析结合偏最小二乘回归分析的近红外光谱方法进行定标建模后进行模型预测，结果显示预测模型显著。

脂环酸芽孢杆菌等耐热细菌是影响果汁生产的质量安全的主要微生物，王若男等（2015）应用傅里叶变换近红外技术对脂环酸芽孢杆菌属内种间的7株不同的标准菌株进行定标建模，模型能100%准确判别标准菌类型。将上述建模的样本混入分离菌后再次定标建模，对15个样本进行预测以验证模型的稳健性和实用性，预测准确率为86.67%。

3 问题与建议

近红外光谱技术的定标模型的建立面临较多的问题。首先，需采集大量的样本光谱与样本的测量参比值，样本量的多少、测量参比值的准确度直接影响到其定标模型代表性、稳定性和准确性，前期定标建模需要耗费大量精力与时间；其次，近红外检测技术是一种间接测量技术，前期选择样本的代表性和测量参比值的准确性以及选择合适计算模型非常重要，而且采集到不同类型的食品微生物的近红外光谱信息特征各异，食品微生物种类繁多等；最后，在采集样本的光谱过程中，样本的基质不同，其中混合其它微生物的种类和量不同均对其有干扰，影响模型的准确度和检测限。这些问题导致定标建模困难，有待在这方面进行深入的研究。

要解决这些问题，可通过权威组织联合进行共享资源，不仅能快速强大采集食品微生物的近红外光谱和其对应实测数据的数据库，还降低人力、物力、财力、信息、时间等成本，实现参与者共赢。近红外光谱区的波长范围在780～2526nm之间，使得近红外光谱技术在食品微生物检测中存在一定的局限，可结合可见光光谱技术和远红外光谱技术等进行应用，以改善弊端，扩大优势。

4 结语与展望

近红外光谱检测具有方便、快速、无损、多组分检测准确和同时进行等优点，适用领域众多，具有广阔的应用前景。尽管其在前期定标建标阶段投入成本较大，但这个成本与后期应用时间长短成反比关系，从长远来看，综合成本持续下降的。相信在不久的未来，近红外光谱技术在食品微生物快速检测技术领域中占据越来越重要地位，促使食品微生物快速检测技术领域迈上一个新的台阶。