植酸酶抗胃蛋白酶的研究

◆作者：崔细鹏 邹嘉豪

◆单位：广东溢多利生物科技股份有限公司，广东饲料添加剂生物工程技术研究开发中心

植酸大量存在于植物种子和花粉中，是植物贮存磷元素的主要形式。植酸磷是一个含六个磷酸基团的环状化合物，因为它影响其他矿物元素的有效性，所以是一种抗营养因子。以植酸磷形式存在的磷因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在0～40%。这导致了诸多的问题，一方面，饲料中85%左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的植酸磷使水和土壤受到严重污染。另一方面，饲料中的磷源不能得到有效利用，从而造成磷源浪费。另外，为了满足动物对磷的需求，必须在饲料中添加无机磷，增加了饲料成本，而高磷粪便又增加了环境污染。

植酸酶是能够降解植酸释放出无机磷的一类酶的总称。但是由于动物和植物中的植酸酶含量很低且难以分离，加之其酶学性质标明不适合在单胃畜禽胃肠道中发挥作用。所以植酸酶开始转向微生物来源的方向，从1968年开始，通过分子生物学和基因工程手段，陆续从真菌、细菌等十多种微生物中分离到植酸酶，得到了对抗蛋白酶强的植酸酶。

本实验通过模拟动物胃的环境，摸索不同植酸酶对饲料原料的分解效率，为植酸酶的应用推广提供可靠的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

仪器：精密 pH 计（0.01）、分析天平（0.01g）、离心机、分光光度计、恒温振荡水浴锅等。

试剂：pH5.5的 0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液。pH2.0的盐酸溶液：称取10.36g NaCl和0.98g KCl，放入 2000mL 烧杯，加入1800mL去离子水溶解，并用2mol/L的HCl调节pH 到2.0，定容至2000mL。模拟胃液：胃蛋白酶浓度为 737.5 U/mL。称取184.38kU（千单位）的胃蛋白酶（sigma P7000） 溶解于 250mL pH2.0的盐酸溶液中，缓慢搅拌直至溶解。临用前配制。10%三氯乙酸溶液。

1.2 底物制备

将常用饲料原料底物小麦、玉米、豆粕、DDGS、菜粕、棕榈粕、米糠烘干粉碎，过24目筛。

1.3 酶样品来源

本试验采用的植酸酶产品来自国内外不同厂家的植酸酶产品。表1是这些酶的基本信息。

表1 植酸酶样品酶活

1.4 试验步骤及测定方法

1.4.1 实验设计

实验设对照组（不加酶）和加酶组。

对照组：称取10.00g底物饲料，按料∶水=1∶10（水指模拟胃液）。与酶解样放在一起，酶解开始后，每隔1h振荡一次，速度120r/min。酶解结束后，加入5mL 10%三氯乙酸溶液，取出酶解样品适量4000r/min离心10min，收集上清液，待测。

加酶组：称取10.00g底物饲料，最终添加植酸酶：1U/g原料；料∶水=1∶10（水指模拟胃液）。酶解温度37℃，共酶解5h，酶解开始后，每隔1h振荡一次，一次10min，速度120r/min。酶解结束后，加入5mL 10%三氯乙酸溶液，取出酶解样品适量4000r/min离心10min，收集上清液，待测。

1.4.2 测定指标

取适量滤液，加10mL钼黄显色剂，用蒸馏水定容至50mL，静置10min后，如澄清无浑浊，直接于420 nm测定OD值(吸光度)，如静置后出现浑浊，则将该混合液摇匀，取 10 mL，4000 r/min离心10min后取清液再测OD值（测定OD值在0.3～0.5，若不在此区域，需调整滤液的量）。

表2 10种植酸酶对7种饲料原料体外酶解无机磷含量的影响（μg/m L）

根据标准曲线计算无机磷的含量（标准曲线绘制参考GB/T 6437-2002）。

植酸酶酶解效率=(加酶组无机磷含量-空白组无机磷含量)÷空白组无机磷含量×100%

2 结果与讨论

2.1 结果

结果见表2、表3。

表3 10种植酸酶对7种饲料原料体外酶解结果:无机磷含量增长率（%）

2.2 分析

各植酸酶产品对豆粕的酶解效率：8＞9＞10＞5＞6＞1＞7＞4＞3＞2；8、9、10 号植酸酶酶解效率最高，无机磷增长率达到1000% 以上；2、3、4 号植酸酶酶解效率较低，无机磷增长率为700%。各植酸酶对豆粕酶解效率明显，各组之间差异显著。

各植酸酶产品对玉米的酶解效率：5＞9＞2＞8＞10、6＞1＞7＞3＞4；各植酸酶对玉米酶解效果明显，5号酶解效率最高，无机磷增长率为1773.8%；4号对玉米酶解效率最低，无机磷增长率为1592.3%，但各组间差异不显著。

各植酸酶产品对小麦的酶解效率：8、9＞2＞10＞7＞6、1＞3＞4＞5；各植酸酶酶解效果对小麦不明显，8号和9号对小麦酶解效果最好，无机磷增长率达到了63.7%；5号植酸酶无机磷增长率仅仅为6.9%。但各组之间差异较显著。

各植酸酶产品对菜粕的酶解效率：8＞9＞10＞3＞6＞7、1＞5＞4＞2；各植酸酶酶解效果对菜粕较明显，酶解效率最高的为8号和9号，无机磷增长率分别为 230.3%和225.6%；2号酶解效率最低，无机磷增长率为154.1%。各组间差异较显著。

各植酸酶产品对DDGS的酶解效率：8、9＞10＞5＞6＞1＞7＞4＞3＞2；各植酸酶酶解效果对DDGS较明显，8号和9号酶解效率最高，无机磷增长率分别为504.6%，各组间差异较显著。

各植酸酶产品对米糠的酶解效率：8＞9、10＞7＞5＞6＞1＞2＞3＞4；各植酸酶酶解效果对米糠较明显，8号和9号酶解效果最高，无机磷增长率分别为360.7%和349.2%，各组间差异较显著。

各植酸酶产品对棕榈粕的酶解效率：10＞9＞8＞5＞1＞7＞6＞4＞2＞3；各植酸酶酶解效果对菜粕较明显，8号、9号和10号酶解效率最高，无机磷增长率分别为174.6%、185.2%和186.0%，各组之间差异不显著。

3 讨论

本试验中的底物存在于饲料原料中，植酸与磷的结合以及植酸酶的左右渗透都需要时间；另一方面，饲料中的矿物质大多数与植酸结合，形成不容易溶解的植酸盐，饲料成分的各不相同使得植酸盐的形式也各不相同，可能导致植酸磷利用变化较大。8号、9号、10号植酸酶对蛋白原料和能量原料酶解效率在所选10种植酸酶中最佳；2号植酸酶对能量原料作用效果好，但对蛋白原料作用效果较差。其原因可能不同来源的植酸酶，分解植酸磷能力不同，抗胃蛋白酶能力不同，也会造成酶解效果的差异。

由于动物体的消化代谢生理过程复杂，且受许多因素影响。该体外试验只是确定添加量为1U/g原料的情况下，研究各个厂家植酸酶在模拟胃液中对饲料底物的酶解效果，而实际的体内效果还需要用进一步验证。