蛹虫草液体发酵菌丝体工艺条件的优化*

王 坤 曲亮璠 王祥河 刘 然 许勤虎

1（天津市工业微生物研究所有限公司，天津 300462）2（天津量信检验认证技术有限公司，天津 300462）3（天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，天津 300462）

冬虫夏草（Cordyceps sinensis）是我国名贵的中药材，其宿主蝙蝠蛾幼虫对生长环境的要求极为严苛，难以实现规模化饲养。野生冬虫夏草资源紧缺，价格昂贵，寻求野生虫草的替代品逐渐成为人们研究的热点。蛹虫草（Cordyceps militaris）是一种药食两用真菌，与冬虫夏草具有相似的化学成分和生物活性。研究表明，蛹虫草内核苷、多糖、甘露醇及甾醇类物质具有抗疲劳、抗衰老、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降三高以及调节免疫系统等药理作用。对蛹虫草进行合理的开发利用，能够满足人们日益增长的保健需求，具有良好的商业价值和广阔的市场空间。目前，我国蛹虫草的人工种植技术已经取得了一定的进展，由于该菌种极易受其他微生物污染，使产品品质降低，影响经济效益。蛹虫草菌丝体液体发酵的方法具有速度快、周期短、产量高、控制条件容易等特点，可以突破气候、环境等因素的限制，避免不利因素对菌种发酵造成的负面影响，适合大规模工业化生产。在真菌发酵过程中，获得大量的生物体是各种功效成分高效积累的基础。目前，维生素B 族对蛹虫草液体发酵的影响鲜有报道，本研究通过正交工艺优化在一定程度上提高了该菌种菌丝体的产量，旨在为蛹虫草资源的科学研究和开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株：蛹虫草（Cordyceps militaris），菌种编号：CICC 14013。

蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AE200 分析天平，Seven Multi pH 计，梅特勒-托利多集团；GZX-9146 MBE 数字鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；MLS-3750 高压灭菌锅，三洋电气公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹虫草液体发酵试验

1.3.1.1 液体菌种的制备

斜面培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂20.0 g/L。

液体菌种培养基：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，硫酸镁1.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L。

取1 cm2大小斜面菌种接入500 mL 的锥形瓶中，装液量为200 mL/瓶，摇床转速180 r/min，温度22 ℃，培养5 d。

1.3.1.2 发酵单因素试验

选取不同磷酸二氢钾、硫酸镁添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）；不同维生素B1、B2、B6、B12添加量（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L），蔗糖40.0 g/L，蛋白胨30.0 g/L，接种量7.5%，摇瓶装液量100/250 mL，pH 6.5，摇床转速180 r/min，22 ℃培养6 d。以蛹虫草发酵产物中的菌丝体生物量为指标，进行单因素试验。

1.3.1.3 正交试验

在上述单因素试验的基础上，进行四因素三水平正交优化试验，以获得蛹虫草液体发酵的最佳条件和最大菌丝体产量。

1.3.2 菌丝体生物量测定方法

菌丝体的生物量采用细胞干重法测定，将发酵产物置于布氏漏斗进行抽滤，弃去滤液，用蒸馏水将菌丝体洗净后，重复上述试验操作，将得到的菌丝体置于60 ℃烘干至恒重。生物量按下式计算：

式中：X——生物量，g/L；

W——细胞干重，g；

V——取样体积，mL。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 磷酸二氢钾添加量对菌丝体产量的影响

磷酸二氢钾添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响如图1 所示。无机盐是微生物菌体组成的一部分，也是一些酶的激活剂或者抑制剂，除此之外，还能够调节液体培养基中的pH 值、氧化还原电位和渗透压。钾元素虽然不参与细胞结构物质的组成，但能改变微生物细胞内膜结构的通透性，能够调节细胞的渗透压；磷元素是微生物细胞内蛋白质和核酸类物质合成的必要成分。随着磷酸二氢钾质量浓度的增加，蛹虫草菌丝体干重呈现先升高后降低的趋势，当磷酸二氢钾质量浓度达到1.5 g/L 时，摇瓶液体发酵获得的生物量达到最大值，为27.24 g/L，比对照组提高了51.33%。

图1 磷酸二氢钾添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响

2.1.2 硫酸镁添加量对菌丝体产量的影响

硫酸镁添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响如图2 所示。虽然无机盐在微生物细胞中的含量很少，但是能对其生长速度和代谢产物产生一定的影响。镁是生物体内不可或缺的元素，镁离子能够激活微生物细胞体内多种酶的活性，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成、磷酸盐的转化等。硫元素是蛋白质的重要组成成分，其重要性仅次于磷，对微生物的生长发育有着至关重要的作用。随着液体培养基中硫酸镁质量浓度从0.5 g/L 上升至2.5 g/L，菌丝体的生物量呈现先升高后降低的趋势，菌丝体干重分别为22.12 g/L、23.15 g/L、23.82 g/L、26.33 g/L、24.50 g/L，相比于对照组的菌丝体干重20.90 g/L 分别提高了5.83%、10.77%、13.97%、25.98%、17.22%，当硫酸镁质量浓度达到2.0 g/L时，蛹虫草液体发酵的菌丝体生物量达到最大值。

图2 硫酸镁添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响

2.1.3 维生素B1添加量对菌丝体产量的影响

维生素B1添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响如图3 所示。大多数维生素是微生物生长代谢过程中某些酶的辅酶，在物质代谢中起重要作用。维生素B1广泛存在于生物体体内，参与某些糖和脂肪的代谢过程，在代谢旺盛的位置含量最高。在一定的浓度范围内，添加维生素B1可以显著促进蛹虫草菌丝体的生长，获得更高的产量。当维生素B1的添加量为30 mg/L 时，液体发酵所得生物量最高，达到26.07 g/L，较对照组提高了11.84%。因此，维生素B1的最适添加量为30 mg/L。

图3 维生素B1 添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响

2.1.4 维生素B2添加量对菌丝体产量的影响

维生素B2添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响如图4 所示。维生素B2参与微生物体内的能量代谢，与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的生化反应息息相关，是许多动物和微生物生长的必需因素。对照组摇床震荡培养发酵6 d 后，菌丝体生物量为23.52 g/L，在10 mg/L～50 mg/L 的添加范围内，其生物量分别为23.27 g/L、23.91 g/L、24.08 g/L、23.14 g/L、24.25 g/L。试验结果表明，维生素B2对蛹虫草生物量没有显著性的影响，该菌种对维生素B2生长因子添加量的变化不敏感。

图4 维生素B2 添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响

2.1.5 维生素B6添加量对菌丝体产量的影响

图5 维生素B6 添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响

维生素B6添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响如图5 所示。维生素B6主要以磷酸吡多醛（PLP）形式参与近百种酶反应，多数与氨基酸代谢有关：包括转氨基、脱羧、侧链裂解、脱水及转硫化作用。对照组摇床震荡培养发酵6 d 后，生物量为23.81 g/L，维生素B6在一定程度上能够促进对蛹虫草菌丝体的生长和繁殖。当培养基中维生素B6质量浓度为40 mg/L 时，菌丝体产量较对照组提高了6.93%，此时促进作用最为明显。

2.1.6 维生素B12 添加量对菌丝体产量的影响

维生素B12添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响如图6 所示。维生素B12又称钴胺素，参与氨基酸和胸腺嘧啶的合成，能够促进微生物的生长发育。在一定的范围内，添加较低浓度的维生素B12（＜30 mg/L）对蛹虫草菌丝体生长的促进作用较为明显，能够获得更高的生物量。当维生素B12的添加量为30 mg/L时，发酵所得生物量最多，达到26.17 g/L，较对照组菌体产量23.54 g/L 提高了11.17%。随着液体培养基中维生素B12含量进一步增加，菌丝体的生物量逐渐降低。因此，维生素B12的最适添加量为30 mg/L。

图6 维生素B12 添加量对蛹虫草菌丝体产量的影响

2.2 正交试验结果

2.2.1 试验因素与水平

根据单因素试验结果，选取对蛹虫草液体发酵菌丝体产量影响较大的磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、维生素B12添加量这4 个因素，以发酵产物中菌丝体干重为指标进行L9(34)的正交试验，正交因素与水平见表1，试验方案及结果见表2。

表1 正交试验因素与水平设计

2.2.2 正交试验结果与分析

表2 正交试验结果

由表2 可知，磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、维生素B12添加量对蛹虫草液体发酵菌丝体的生物量均有显著性影响，极差值分别为1.833、1.776、0.836、1.486，4 个因素对其响应值的影响主次顺序为：磷酸二氢钾添加量＞硫酸镁添加量＞维生素B12添加量＞维生素B1添加量。最佳发酵条件为：磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁2.0 g/L，维生素B130 mg/L，维生素B1230 mg/L。

2.2.3 优化条件的验证

表3 验证试验结果

由正交试验优化出蛹虫草发酵菌丝体的最佳工艺（A2B2C2D2）并未在正交试验表中出现，所以需要进行验证试验，试验结果如表3 所示。液体发酵培养基中磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁2.0 g/L，维生素B130 mg/L，维生素B1230 mg/L时，蛹虫草菌丝体干重达到28.23 g/L，高于各试验组所得数据，说明工艺优化试验有效。

3 结 论

蛹虫草菌株可以利用多种B 族维生素作为生长因子。在液体培养基中添加维生素B1、维生素B6、维生素B12能够显著提高菌丝体的生物量；而添加维生素B2对蛹虫草菌丝生物量的影响不显著。

以蛹虫草液体发酵菌丝体的生物量为优化指标，通过四因素三水平正交试验优化蛹虫草菌丝体发酵工艺，得到最佳发酵条件为：磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁2.0 g/L，维生素B130 mg/L，维生素B1230 mg/L，此时菌丝体产量为28.23 g/L。