热灭活副干酪乳杆菌Lc19对小鼠便秘的缓解作用研究

陈建国，李周勇，李桂花，周晓娟，桑跃，俞伟祖

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3.河北省畜产食品技术创新中心，廊坊 065201）

随着饮食结构的改变及精神和社会压力的增大，便秘已成为困扰现代人健康的主要问题之一，严重影响着人们的生活质量。最近的调查显示，在亚洲，便秘的发病率为9.6%，在欧美国家，便秘的发病率为8.1%[1]。在我国，便秘的发病率为5%～16%[2,3]。便秘的原因大多数为饮食不正常，通过改变饮食结构来缓解便秘是一种安全又有效的方法。

研究表明，通过口服活的益生菌，对肠道菌群结构进行平衡和调节，可带来显著的通便效果，这已成为近年来健康治疗功能性便秘大量采用的方法[4,5]。但是对于热灭活的益生菌是否也能缓解便秘，国内外文献还鲜有报道。Takii等[6]研究了泡菜中活的和死的植物乳杆菌对于便秘人群的作用，结果表明两种菌都可以缓解便秘。Katayama等[7]研究表明，热灭活的副干酪乳杆菌可以缓解人群的便秘。益生菌缓解人群的便秘具有一定的菌株特异性，副干酪乳杆菌Lc19 (Lactobacillus para casei Lc19)是一株从长寿老人粪便中分离得到的益生菌株。本研究的目的是通过建立便秘小鼠模型评价活的与热灭活的副干酪乳杆菌Lc19的润肠通便功能，为益生菌乳饮料的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BALB/c雄性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。副干酪乳杆菌Lc19，由蒙牛乳业集团基础科学部菌种中心提供。

复方地芬诺酯片（批号1109026），为常州康普药业有限公司产品；活性炭粉，为巩义市嵩山滤材活性炭厂产品；阿拉伯树胶，为广东汕头市西陇化工厂产品；MRS培养基，为北京奥博星生物技术有限公司产品。

1.2 仪器与设备

SW-CJ医用型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ZDX35BI高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；DNP9082恒温培养箱、DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；3K30型低温高速离心机、ACCULAB分析天平（德国Satorious公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

活菌菌悬液的配制：将副干酪乳杆菌Lc19菌株用MRS液体培养基37℃培养12h，4500r/min离心15min，菌体沉淀重悬于MRS液体培养基中，用生理盐水配制不同浓度的菌悬液。

热灭活Lc19菌悬液的配制：将副干酪乳杆菌Lc19用MRS液体培养基37℃培养12h，121℃、15min灭菌，然后4500r/min离心15min，菌体沉淀重悬于MRS液体培养基中，用生理盐水配制不同浓度的菌悬液。

墨汁的配制：准确称取阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性碳 (粉状) 50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷却后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前摇匀。

复方地芬诺酯混悬液(0.05 g/100 m L及0.025g/100mL)的配制：分别取复方地芬诺酯片（每片含复方地芬诺酯2.5mg）20片、10片，用研钵研碎呈粉末后加水至50mL。临用前配制。

1.3.2 实验动物分组及处理

实验小鼠分为死菌组、活菌组、空白组和模型组。死菌与活菌组分别设置高低两个剂量组，分别灌胃4×109、4×1010CFU/mL的Lc19菌悬液0.1mL/（kg·d）（以体重计，下同），空白组和模型组小鼠灌胃质量分数为9%的生理盐水0.1mL/（kg·d）；每天一次，实验期间自由进食，记录各组小鼠体重变化。

1.3.3 小鼠排便实验

给受试样品7d后，各组小鼠禁食不禁水16h。模型组、死菌组与活菌组小鼠灌胃给予复方地芬诺酯（10mg/kg），空白组给予生理盐水。8×109、8×1010CFU/mL的Lc19死菌的菌悬液和8×109、8×1010CFU/mL的Lc19活菌的菌悬液，均与墨汁等体积混合，给予复方地芬诺酯0.5h后，空白组和模型组小鼠灌胃墨汁0.1mL/kg，益生菌Lc19活菌组与死菌组给予含受试样品的墨汁0.1mL/kg，动物均单笼饲养，正常饮水进食。从灌胃墨汁开始，记录每只动物首次排黑便时间、5h内排黑便粒数、质量。收集的粪便在105℃烘干至恒重，按式(1)计算粪便含水率。

1.3.4 小肠推进实验

给受试样品15d后，各组小鼠禁食不禁水16h。模型组、死菌组与活菌组小鼠灌胃给予复方地芬诺酯（5mg/kg），空白组给予生理盐水。给复方地芬诺酯0.5h后，Lc19活菌组与死菌组分别给予含受试样品的墨汁0.1mL/kg（样品剂量同1.3.3小鼠排便实验），对照组灌胃墨汁0.1mL/kg。25min后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按式(2)计算墨汁推进率。

1.4 数据处理

墨汁推进率需进行数据转换， ，式中：A为墨汁推进率，结果用小数表示。在进行方差分析时，先使用方差分析程序做方差齐性检验，方差齐后，计算F值，F＜0.05，则各实验组平均数间不存在显著性差异，若F≥0.05、P≤0.05，表明各组均数之间存在显著性差异；用一个对照组同每个实验组数据进行秩和t检验。

2 结果与讨论

2.1 小鼠体重变化

表2 Lc19对便秘模型小鼠各排便指标的影响 (n＝10)

表1 实验小鼠体重变化 (n＝10)

由表1可知，试验期间小鼠的体重在各剂量试验组与空白组间比较，均不存在显著性差异（P＞0.05），表明试验过程中副干酪乳杆菌Lc19对雄性小鼠的体重没有显著性影响，本研究是在小鼠生理常态条件下进行的。

2.2 小鼠排便实验结果

实验小鼠每天一次经口灌胃副干酪乳杆菌Lc19的活菌体与死菌体，连续7d后测定对便秘模型小鼠首次排黑便时间、5h内排黑便粒数、质量及粪便含水率的影响，结果见表2。与空白组比较，模型组小鼠首次排黑便时间、5h内排黑便粒数、排便质量和粪便含水率均有极显著性差异（P＜0.01），说明便秘小鼠模型成立。

由表2可知，Lc19的活菌体与死菌体经口灌胃7d后，对于首次排黑便时间，活菌组、死菌组与模型组相比具有极显著差异（P＜0.01），活菌组低于死菌组；对于5h内黑便质量，活菌组与死菌高剂量组与模型组相比具有极显著差异（P＜0.01），死菌低剂量组与模型组具有显著差异（P＜0.05），活菌组高于死菌组；对于5h内黑便粒数，活菌组、死菌组与模型组相比具有极显著差异（P＜0.01），活菌组高于死菌组；对于粪便含水率，活菌组、死菌组与模型组相比没有显著差异（P＞0.05）。

2.3 小肠推进实验结果

小肠运动有3种方式，即张力收缩、分节运动和蠕动，主要以蠕动力推动肠内容物运动为主要方式[10]。本实验经口灌胃给予小鼠止泻剂复方地芬诺酯是一种便秘模型造模常用药物[11]，其作用主要是直接作用于肠道平滑肌，通过抑制肠黏膜感受器，消除局部肠黏膜蠕动反射而使肠道蠕动减慢，使肠内容物通过延迟，致使小鼠排便困难，与便秘临床症状相近。经灌胃建立小鼠小肠蠕动抑制模型后，再通过墨汁标记观察Lc19活菌体与死菌体对便秘小鼠肠道蠕动的影响。实验小鼠连续灌胃副干酪乳杆菌Lc19的活菌体与死菌体15d后，进行小肠推进实验，结果见表3。

表3 Lc19对便秘小鼠小肠墨汁推进率的影响 (n＝10)

由表3可知，模型组墨汁推进率明显低于空白组（P＜0.01），墨汁推进实验小鼠便秘模型造模成功。灌胃15d后，活菌组、死菌高剂量组小肠推进率与模型组相比，极显著增加（P＜0.01），死菌低剂量组显著增加（P＜0.05），且出现剂量效应，随菌浓度的提高，便秘小鼠的墨汁推进率增加。

3 结论

本试验通过灌胃复方地芬诺酯建立小鼠的便秘模型，以小鼠的首次排便时间、排便粒数和质量、粪便水分含量和墨汁推进率等指标评价活的与热灭活的副干酪乳杆菌Lc19对便秘模型小鼠的通便功能。综合试验数据可以看出，Lc19的活菌体与死菌体都可以改善便秘模型小鼠的排便能力。活菌体与死菌体相比可以显著改善便秘模型小鼠的排便能力，活菌组与死菌组改善便秘的能力均存在剂量效应，活菌高剂量组改善便秘的能力大于低剂量组，死菌高剂量组改善小鼠便秘的能力大于低剂量组。