诊断超声结合左心声学造影剂在血栓溶解方面的初步研究

王洋，林静茹，王浩，朱振辉，逄坤静，孟健，徐振雨，王学民，吴伟春

超声检查因其具有价廉、方便以及无辐射等优点，一直是疾病诊断的首选检查项目，但是近年来随着新技术、新仪器和超声造影剂的迅速发展，超声已经发展至治疗领域。就血栓性疾病而言，临床溶栓治疗主要是使用药物，并发症较多[1-2]。新近报道超声对其有明确溶栓作用的研究主要是在治疗超声照射下证实的，文献中鲜有关于诊断超声溶栓的报道。我们于2018 年7 月至2019 年2 月采用诊断超声条件，研究超声造影剂声诺维在诊断超声照射下是否具有明显的血栓溶解效果。

1 材料与方法

实验试剂与仪器： Vivid E9 彩色多普勒超声诊断仪（美国通用电气公司，探头包括线阵探头L9和扇形探头M5Sc）、AR3130 电子精密天平（Ohaus Corp.Pine Brook,Nj,美国）、恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）、超声造影剂声诺维（Bracco Suisse SA，意大利）、尿激酶（天津生物化学制药有限公司）、0.9%生理盐水（华润双鹤药业股份有限公司）。

实验材料：（1）血栓的制备：抽取新西兰大白兔血液制成49 份血栓。具体方法是使用一次性静脉输液针从兔子耳缘静脉抽取适量血液，然后在常温下静置3 h 左右，体外形成血栓条（直径约0.4 cm，长约20 cm）。（2）造影剂的准备：在使用前加入5 ml注射用生理盐水（0.9%氯化钠），用力振摇后形成微泡混悬液，然后备用。

实验方法：（1）每份血栓在实验前均用生理盐水冲洗3 遍、滤纸吸干10 s，最后在千分之一天平上秤取其血栓的初始重量为W0。然后将49 份血栓随机分为7 组：单纯生理盐水组（1 ml 生理盐水与血栓作用180 min）；单纯尿激酶组（浓度为10 000 U 的尿激酶1 ml 与血栓作用180 min）；单纯造影剂组（声诺维1 ml 与血栓作用180 min）；生理盐水+超声照射组（1 ml 生理盐水与血栓作用150 min，超声照射30 min）；尿激酶+超声照射组（浓度为10 000 U 的尿激酶1 ml 与血栓作用150 min，超声照射30 min）；造影剂+超声照射组（声诺维1 ml 与血栓作用150 min，超声照射30 min）；造影剂+尿激酶+超声照射组（声诺维0.5 ml、浓度为10 000 U 的尿激酶0.5 ml，混合液与血栓作用150 min，超声照射30 min）。将称重好的血栓放入1.5ml 离心管中，管中试剂总量均为1 ml，离心管置于37°恒温水槽中，超声探头放于水中，距离心管约2 cm 处垂直照射。照射完毕后，取出血栓，生理盐水冲洗3 遍，滤纸吸干10 s 后天平秤取重量计为W1，计算溶栓率。溶栓率=[（W0-W1）/W0]×100%。（2）超声照射采用GE 公司的Vivid E9 彩色多普勒超声诊断仪，探头包括线阵探头L9（头端接触面为14 mm×53 mm），频率2.4～10.0 MHz；扇形探头M5Sc（头端接触面为17 mm×26 mm），频率1.5～4.6 MHz。超声照射频率设为2 MHz、2.5 MHz、3 MHz，机械指数（MI）调至1.3,深度设为4 cm，增益、TGC 等参数均在实验中保持不变。

病理分析:处理后的血栓组织由4%甲醛固定、脱水包埋制成石蜡块，然后切片拷片、染色后封片，用全自动数字切片扫描机器观察结果。该实验用到的染色方法包括常规的苏木素-伊红染色以及改良马松染色（丽春红品红染色液、磷钼酸溶液、苯胺蓝染色液）。

统计学方法：数据采用SPSS 23.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，应用单因素ANOVA 分析（方差分析）进行组间均数比较和两两比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 诊断超声结合超声造影剂对体外血栓的溶解情况

经过30 min 的诊断超声照射，最后7 组血栓的溶解情况（表1～3）：在诊断超声条件下，照射频率为2 MHz、2.5 MHz 及3 MHz 时，无论是线阵探头还是扇形探头，单纯尿激酶组溶栓率均较单纯生理盐水组明显升高（P 均＜0.05）。生理盐水+超声照射组及造影剂+超声照射组溶栓率均较尿激酶+超声照射组及造影剂+尿激酶+超声照射组明显降低（P＜0.05），单纯尿激酶组、尿激酶+超声照射组和造影剂+尿激酶+超声照射组3 组间溶栓率差异无统计学意义（P＞0.05）；生理盐水+超声照射组和造影剂+超声照射组比较，溶栓率差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 诊断超声（扇形探头M5Sc） 频率2 MHz、机械指数 1.3、辐照时间30 min 时各组的溶栓率（ n=7,±s）

表1 诊断超声（扇形探头M5Sc） 频率2 MHz、机械指数 1.3、辐照时间30 min 时各组的溶栓率（ n=7,±s）

注： W0：血栓实验前重量；W1：血栓实验后重量。与单纯生理盐水组比较*P＜0.05;与尿激酶+超声照射组比较ΔP＜0.05；与造影剂+尿激酶+超声照射组比较▲P＜0.05

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表2 诊断超声（扇形探头M5Sc） 频率2.5 MHz、机械指数 1.3、辐照时间30 min 时各组的溶栓率（ n=7,±s）

表2 诊断超声（扇形探头M5Sc） 频率2.5 MHz、机械指数 1.3、辐照时间30 min 时各组的溶栓率（ n=7,±s）

注：W0：血栓实验前重量；W1：血栓实验后重量。与单纯生理盐水组比较*P＜0.05;与尿激酶+超声照射组比较ΔP＜0.05；与造影剂+尿激酶+超声照射组比较▲P＜0.05

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表3 诊断超声（线阵探头L9） 频率3 MHz、机械指数 1.3、辐照时间30 min 时各组的溶栓率（ n=7,±s）

2.2 病理结果

苏木素-伊红染色显微镜下观察结果：7 组血栓组织经过染色后显微镜下呈现出相似的表现（图1）：均由红细胞、纤维蛋白以及少数炎症细胞等构成。红细胞呈现出红色的圆形结构、散在分布或密集堆积排列；纤维蛋白呈现出淡粉色的片状结构；炎症细胞呈现出蓝紫色的小圆颗粒样结构。

改良马松染色显微镜下观察结果：7 组血栓组织经过染色后显微镜下均可观察到蓝色的条带状、片状结构以及堆积的红细胞结构（图2）。蓝色区域处仅有散在分布的少数红细胞，还含有一些炎症细胞，蓝色结构大部分分布于血栓组织的边缘。

图1 七组血栓组织溶解后苏木素-伊红染色结果图（×20）

图2 七组血栓组织溶解后马松染色结果图（×10）

3 讨论

文献报道超声对血栓的溶解作用主要表现在两个方面：（1）超声仪器及条件方面：超声直接溶栓的作用机制尚未完全清楚[3-4]，目前认为可能的原理主要包括空化作用、热效应以及机械效应三个方面。有研究表明，超声微泡溶栓、助溶作用机制主要是空化效应。主要指液体中的微小气泡在超声波作用下发生振荡、膨胀、收缩以及爆裂的一系列过程，这样就能把能量聚焦出现溶栓作用。但是目前该方面的研究主要集中于治疗超声条件，使用的是治疗超声仪器，比如重庆医科大学超声影像研究所研制的超声治疗仪器：低强度聚焦超声仪器（LIFU），其参数多设置为低频率[5]、高能量的治疗条件，在这种条件下的溶栓作用是十分明确的。然而我们工作中使用的超声仪器基本为诊断仪器，因为需要满足对受检人体安全无害的要求，所以设置的频率相对较高、能量相对较低，而该条件下的溶栓效果却鲜见报道；此外，高强度聚焦超声（HIFU）也可以对血栓起到明显的溶解作用[6]。（2）微泡造影剂方面：目前国内外已经研制出多种具有明确溶栓作用的造影剂，该类型造影剂具有到达靶目标（血栓）的能力，并在靶目标处高浓度聚集且结合牢固[7]，而且在超声探测期间能够保持一定的稳定性。比如MRX-408A1（可提高犬急性下腔静脉血栓和犬急性左心耳血栓的显示率，有区别急慢性血栓的能力）[8]和靶向超声免疫脂质体ELIPs（其可与抗纤维蛋白原结合，从而增强左心室血栓的超声显像）[9]，但是这些靶向溶栓造影剂均没有在临床上广泛应用，其中的原因可能与安全性、稳定性等因素相关。目前国内市售的安全稳定的造影剂主要是意大利Bracco公司生产的声诺维（SonoVue），这种造影剂未见有溶栓效果的报道。我们设想，如果对人体安全无害的诊断超声仪器和安全稳定的微泡造影剂声诺维联合使用，如果能够出现明确的溶栓作用，那么对于临床上许多栓塞性疾病的治疗是一个福音。

本实验研究结果经过统计学分析后，表明诊断超声结合微泡造影剂声诺维并没有表现出明确的溶栓效果。其中的原因可能包括以下几点：（1） 造影剂：因为声诺维是普通造影剂，没有亲附血栓作用，所以不会特异性的在血栓处聚集，所以血栓处的空化效应与其他位置的空化效应并没有显著差异。此外，造影剂的剂量也是一个影响因素，在安全剂量的前提下血栓的溶解效果不明显；（2）超声照射时间：本实验在照射30 min 后未出现明确的溶栓作用。根据文献报道，超声照射时间越长溶栓效果就越明显，如果以此推测，本实验结果可能与辐照时间短有关系，这也是本实验组考虑到临床实践工作中的实际情况没有做相关方面的进一步研究；（3）超声频率：文献报道超声辐照频率越低，溶栓效果越明显。而治疗超声的频率多小于1 MHz，在这个频率范围内的溶栓效果是确切的，当频率大于1 MHz 时溶栓作用会减弱甚至不出现溶栓作用，本实验限定在诊断超声领域，而且使用的是临床上常规使用的超声诊断仪器，其频率均大于1 MHz，在此条件下溶栓作用就相对较弱。

单纯尿激酶组、尿激酶+超声照射组和造影剂+尿激酶+超声照射组3 组比较溶栓效果一致。众所周知尿激酶是临床上很成熟的溶栓药，溶栓效果显著，但是最大的副作用就是出血风险，减少使用剂量可以降低这种情况的发生， “造影剂+尿激酶+超声照射组”的尿激酶剂量是“单纯尿激酶组” 和“尿激酶+超声照射组”剂量的一半，所以“造影剂+尿激酶+超声照射组”在安全性方面优于“单纯尿激酶组”和“尿激酶+超声照射组”；而出于经济方面的考虑，“尿激酶+超声照射组”优于“造影剂+尿激酶+超声照射组”。

血栓组织的病理染色结果表明：对于血栓溶解程度病理部分并没有发现合适的定量指标，而且由于实验条件的限制本次实验的病理部分只做了苏木素-伊红染色和改良马松染色。苏木素-伊红染色显示，由于红细胞不是单层平铺于载玻片上，而是堆积排列，所以通过红细胞之间的空隙大小以及红细胞排列的均匀程度难以准确评价溶栓效果；此外，由于选取观察视野的主观性和随机性，用红细胞数量变化也难以客观评价溶栓效果。马松染色显示，蓝色区域为红细胞破裂的主要区域，蓝色区域越多则说明红细胞被溶解的越多，但是对于这种变化没有合适客观的量化指标。本实验未进行电镜扫描观察，电镜下可以看到纤维网的结构，也许可以观察到纤维网是否出现断裂现象。

综上所述，诊断超声结合超声造影剂（声诺维）对血栓没有明显的溶解作用。单纯尿激酶组、尿激酶+超声照射组和造影剂+尿激酶+超声照射组3组比较溶栓效果一致。出于安全方面的考虑，造影剂+尿激酶+超声照射组优于单纯尿激酶组和尿激酶+超声照射组；而出于经济方面的考虑，尿激酶+超声照射组优于造影剂+尿激酶+超声照射组。该实验为诊断超声条件下血栓溶解的相关研究进行了一些初步的尝试，我们课题组也将继续在相关方面做进一步的深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突