改性芸豆蛋白添加量对香肠品质影响的研究

吴海涛，富天昕，张 舒，冯玉超，李玉琼，王长远

（1.黑龙江八一农垦大学理学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

芸豆，学名菜豆，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和脂肪等物质，且具有高镁、高钾、低钠的特性，故在营养治疗方面具有良好的应用性[1-2]。芸豆中蛋白质含量高达20.29%～27.73%，且富含18种氨基酸[3-4]，研究表明，芸豆中含有的多种球蛋白和皂苷等物质具有提高免疫力、增强抗病能力、降血压和血脂的作用，说明芸豆蛋白具有一定的保健及药用功能[5-6]。近年来，植物蛋白在食品中的应用逐渐增多，杨震等人[7]将豌豆蛋白加入到香肠中，发现豌豆组织蛋白添加量为4%时，香肠的颜色和质构特性效果更好。徐慧[8]将大豆蛋白加入到猪肉脯中，进行新型猪肉脯的研发，色泽与风味独特、适用于工业化生产，且肉糜肉脯成型好。石晓等人[9]将花生蛋白加入到火腿肠中，当花生蛋白的添加量为4%左右时，火腿肠肉糜的得率增大，其质构特性也得到改善。

蛋白质改性是通过物理、生化因素使氨基酸和多肽链发生某种变化，从而改变蛋白大分子空间结构和理化性质，获得较好功能特性和营养特性的蛋白质，进而增加其在食品加工中的应用范围。封小龙[10]采用酶法对花生蛋白进行改性，乳化脂质构分析确定改性花生蛋白组分可以应用到香肠中，且对香肠品质有一定改善。娄巍等人[11]将改性的大豆浓缩蛋白加入到火腿肠中，发现添加改性大豆浓缩蛋白火腿肠的持水性、咀嚼性、内聚性、硬度和弹性等性质较添加未改性大豆浓缩蛋白火腿肠的效果有大幅度提高。J Feng等人[12]采用酶法对大豆蛋白进行酶解，将大豆蛋白加入到猪肉法兰克福香肠中，香肠的质构特性变好。金牧等人[13]采用酶法对大豆分离蛋白进行改性，并将改性后的蛋白加入到法兰克福香肠中，结果表明，在添加水解度为4%，交联2 h的条件下，添加改性蛋白的香肠的持水性和抗氧化能力达到最佳，并且储存的稳定性也得到改善。

芸豆蛋白营养丰富，且功能性良好，加入到肉制品中不仅可以均衡其营养组成、赋予良好风味、提升功能性，还可以降低成本。试验通过糖基化的方式对芸豆蛋白进行改性，并研究改性芸豆蛋白对猪肉香肠品质特性的影响，确定改性蛋白在猪肉香肠中的最适添加量，为芸豆蛋白的应用方向和精深加工提供参考，对香肠肉制品的养分均衡提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

红白花芸豆，市售；芸豆蛋白，实验室自制，纯度为80.03%；氨基葡萄糖盐酸盐，中国医药上海化学试剂公司提供；十二烷基硫酸钠，Sigma试剂公司提供；氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，以上试剂均为分析纯，天津市科密欧试剂有限公司提供；猪后腿肉、猪肥膘、肠衣，均为市售；食盐，中国盐业总公司提供；亚硝酸钠，食品级，郑州广宇食品添剂有限公司提供。

1.2 主要仪器设备

FS-450N型超声波处理器，邯郸海拓机械科技有限公司产品；WS型多管架离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；磁力搅拌器，江苏宏华仪器厂产品，AR223CN型电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；C/710型灌肠机、C/E22型斩拌机，意大利laMinera公司产品；HI99163型便携式肉用pH计，意大利Hanna公司产品；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司产品；TA-XT2i Plus型质构仪，英国Stable Micro Systems公司产品；CR-400型色差仪，日本柯尼卡美能达控股公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 改性芸豆蛋白的制备

芸豆蛋白改性参照李玉琼等人[14]的方法进行。配置质量浓度为9 mg/mL的芸豆蛋白溶液，采用浓度为0.1 mol/L的HCl和NaOH调节pH值至9.75，然后进行30 min的磁力搅拌，以质量比1∶2（芸豆蛋白∶氨基葡萄糖）添加氨基葡萄糖，加糖后进行磁力搅拌20 min，调节pH值，再进行10 min的磁力搅拌。将混合液预热至70℃后进行超声处理，超声功率270 W，超声时间40 min；立即将混合液冷却至室温，以转速4 000 r/min离心15 min，去沉淀，将上清液装入到透析袋中，在4℃条件下透析48 h，中间换水2次，透析结束后进行冷冻干燥，备用。

1.3.2 改性芸豆蛋白溶解性的测定

溶解性的测定参照氮溶解指数（NSI）法[15]并略加改动，取0.5 g改性芸豆蛋白样品，加20 mL磷酸盐缓冲液，再将pH值分别调至2，4，6，7，8，10，之后进行45 min的搅拌，然后以转速3 000 r/min离心30 min，离心后的上清液用于蛋白质含量的测定，采用福林酚法进行测定。以牛血清白蛋白为标准物进行标准曲线的绘制。按照公式（1）计算。

1.3.3 改性芸豆蛋白起泡性及起泡稳定性的测定

起泡性和起泡稳定性的测定参照Motoi H等人[16]的方法。称取0.4 g改性芸豆蛋白样品，并溶于20 mL蒸馏水中，分别调节pH值至2，4，6，7，8，10，然后进行磁力搅拌1 h，以转速4 000 r/min离心20 min，上清液以转速9 500 r/min进行高速搅打，时间2 min，搅打结束后测定泡沫体积，此时的体积记作V0，然后将蛋白溶液静置30 min，再次测量泡沫体积，此时的体积记作记V1，按公式（2） 和（3） 计算起泡性和起泡稳定性。

1.3.4 改性芸豆蛋白乳化性及乳化稳定性的测定

称取0.4 g改性芸豆蛋白溶于20 mL蒸馏水中，调节pH值至2，4，6，7，8，10，搅拌1 h后，以转速4 000 r/min离心20 min，取上清液并向其中加入5 mL色拉油，以转速9 500 r/min离心2 min，停止后立即于底部取出50 μL的蛋白溶液，再用质量分数为0.1%SDS溶液进行稀释，混合均匀并立即测定吸光度（波长500 nm），此时的吸光度记为A0，SDS溶液作为空白对照。蛋白溶液静置30 min后再测定，此时的吸光度值记为A1。按照公式（4） （5）计算改性芸豆蛋白的乳化活性（EAI）及乳化稳定性（ESI）[17]。

式中：C——样品质量浓度，g/mL；

Φ——乳化液中油相的比例，0.25；

L——比色皿长度，1 cm；

N——稀释倍数；

A0——乳化液的初始吸光度；

A1——静置30 min后乳化液的吸光度。

1.3.5 改性芸豆蛋白疏水性测定

参照Cardoso J C等人[18]的ANS荧光探针法进行疏水性的测定。用磷酸盐缓冲液配置质量分数为0.2%的改性芸豆蛋白溶液，将20 μL的浓度为8.0 mmol/L的ANS的磷酸盐缓冲液加入4.0 mL的蛋白溶液中，于25℃下保温1 h。激发波长和发射波长分别设置为390 nm和470 nm，狭缝宽度为5 nm。将磷酸盐缓冲液作为空白对照，以荧光强度为纵坐标、样品质量浓度为横纵坐标作曲线，直线斜率即为样品的表面疏水性（H0）。每组试验平行3次测定，结果表示方式为平均值±标准偏差。

1.3.6 香肠的制备

香肠原料配比为，猪腿肉和改性芸豆蛋白共64%，其中改性芸豆蛋白添加量分别为0，1%，2%，3%，4%，5%（猪腿肉适量减少百分比），猪肥膘比例为16%，食盐比例为3%，再加入17%的冰水。腿肉去筋后备用，并将腿肉和猪肥膘切成2 cm左右的立方块，再按照0.1 g/kg加入亚硝酸盐，加食盐，于4℃冷藏条件下腌制24～48 h，呈粉红色即可。将猪腿肉和猪肥膘用绞肉机绞碎，然后将猪腿肉放入斩拌机，并向其中加入冰水和适量糖基化改性的芸豆蛋白斩拌3 min左右，再加入猪肥膘斩拌5 min，将斩拌均匀的肉糜转入灌肠机进行灌制，于80℃水浴中煮制30 min，出锅后用水冷却至室温，4℃条件下保存待检测。

1.3.7 香肠得率的测定

将分别添加0，1%，2%，3%，4%，5%改性芸豆蛋白的猪肉肠煮熟后，擦去表面的水分进行得率的测定，按照公式（6）进行计算。

1.3.8 香肠pH值测定

采用国标法进行pH值测定，参照GB/T 9695.5—1988进行操作。样品均质后用pH计测定，同一个香肠样本设置3组平行，取平均值。

1.3.9 香肠色度测定

将香肠均匀切成3 cm厚的圆柱体后，于色度测定仪进行色度的测定。其中L*值代表亮度，a*值、b*值代表色度的色彩分量。

1.3.10 香肠质构测定

去除肠衣，切成2 cm左右的柱形体。采用P/36R探头的质构仪以2 mm/s的速度对香肠柱形体进行连续2次的挤压测定。平行3次，取均值。

2 结果与分析

2.1 溶解性分析

首先进行标准曲线的绘制（牛血清白蛋白作为标准物），不同浓度梯度溶液于540 nm处测定吸光度，并以吸光度作为纵坐标，蛋白质质量浓度作为横坐标。

标准曲线图见图1，改性芸豆蛋白溶解性的测定见图2。

图1 标准曲线图

图2 改性芸豆蛋白溶解性的测定

由图2可知，pH值小于4时，溶解性呈下降趋势，pH值为4时溶解性最差，此时的pH值应为改性芸豆蛋白的等电点，当pH值大于4时，改性芸豆蛋白的溶解性呈上升趋势。过酸或过碱均会破坏蛋白质分子的次级键，使部分极性基团解离，从而产生静电排斥作用，使蛋白质与结合物分离[19]，溶解性的升高一方面可能是因为芸豆蛋白与氨基葡萄糖接枝后，引入了亲水性的氨基，从而在改性芸豆蛋白的分子表面形成一层水化膜，故溶解性增大；另一方面则可能是氨基葡萄糖分子空间大，结构稳定，导致改性芸豆蛋白质分子之间受到阻碍，故不易聚沉。有研究表明，大豆和大米蛋白糖基化改性后其溶解性可提高1～4倍[20-21]。

2.2 乳化性和乳化稳定性分析

改性芸豆蛋白的乳化性见图3。

图3 改性芸豆蛋白的乳化性

由图3可知，改性后的芸豆蛋白的乳化性和乳化稳定性均呈先下降后上升的趋势。在等电点附近改性芸豆蛋白的溶解性最低，使亲水、亲油基团的乳化作用变差，故乳化性变低。当芸豆蛋白与氨基葡萄糖分子接枝后，亲水基团增加，在大分子氨基葡萄糖的阻碍下使改性芸豆蛋白分子难以聚沉，阻止了油相的聚集，故使改性芸豆蛋白的乳化性和乳化稳定性提高。试验结果与糖基化改性的大豆蛋白[22]的乳化性和乳化稳定性的变化情况相似。

2.3 起泡性和起泡稳定性分析

芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的起泡性见图4。

图4 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的起泡性

由图4可知，改性芸豆蛋白的起泡性变化较大，呈现先下降后上升的趋势，等电点前起泡性下降，等电点后起泡性增加，等电点时达到最低，这可能在于等电点附近溶解度最差，而泡沫是蛋白溶液中可溶性部分参与的，故此时起泡性最差。随着pH值的增大，使改性芸豆蛋白表面的负电荷增多，亲水性增强，同电荷下分子间斥力增加，导致蛋白分子内的疏水基团更多地暴露出来，从而使起泡性提高[23]。同时这也说明起泡性与蛋白质的溶解性存在着一定的联系。改性芸豆蛋白起泡稳定性在pH值为4时最佳，这是因为等电点附近，未溶解的改性芸豆蛋白的黏合力增强，从而稳定了泡沫，故起泡稳定性增强。

2.4 疏水性分析

经测定，改性芸豆蛋白疏水性值为1 507±22.56，芸豆蛋白的疏水性值为1 760±20.35，可见改性后芸豆蛋白的疏水性降低。这是因为芸豆蛋白与氨基葡萄糖分子接枝后，亲水分子增加，则其分子内部的疏水性结合位点的暴露程度变小，从而使得蛋白质分子表面的疏水性减小。此部分结果与卵蛋白[24]的二级结构的研究分析所得出的结论相符合。

2.5 改性芸豆蛋白添加量对香肠品质的影响

蛋白添加量对香肠品质的影响见图5。

图5 蛋白添加量对香肠品质的影响

由图5可知，改性芸豆蛋白量的增加，使香肠的得率呈上升趋势，当添加量为5%时，其得率最大，为93.99%。出现这种趋势的原因可能是香肠中的脂肪和水与芸豆蛋白可形成一定的稳固作用，当改性的芸豆蛋白加入后，其持水性和乳化性都得到改善，所以保水性更好，减少了蒸煮过程中的香肠的损失，从而使得率升高[25]。因豆类蛋白质可能具有致敏性，所以国外对香肠中豆类蛋白的添加量已有规定，如法国食品法律要求大豆蛋白添加量要小于2%[26]，美国要求香肠中大豆分离蛋白添加量不能超过2%[27]，故除对香肠品质具有影响外，也应注意芸豆蛋白的致敏性。

2.6 改性芸豆蛋白添加量对香肠pH值的影响

改性芸豆蛋白的添加量对pH值的影响见图6。

图6 改性芸豆蛋白的添加量对pH值的影响

由图6可知，香肠的pH值随着改性芸豆蛋白添加量的增多而增大，但是整体变化幅度不大，pH值相差0.62左右，这可能与改性芸豆蛋白本身的pH值和食盐含量[28]有关，食盐含量固定，故香肠的出品率和保水性较稳定，故pH值变化不大。

2.7 蛋白添加量对香肠色度的影响

改性芸豆蛋白添加量对香肠色度的影响见表1。

表1 改性芸豆蛋白添加量对香肠色度的影响

由表1可知，纯后腿肉的香肠样本，即改性芸豆蛋白添加量为0%时作为对照组，由表中数据可知，随着改性芸豆蛋白添加量的增加，香肠的亮度呈减小趋势，但幅度不大，香肠的红度呈减小趋势，但黄度呈增大趋势，当在添加量为3%～5%时，黄度增加明显。肌肉蛋白与NaNO2反应，会形成亚硝基血红蛋白和亚硝基肌红蛋白，使得香肠煮制后产生红润的色泽，且色泽稳定[29]。红度减小的部分原因是随着蛋白添加量的增加，香肠中的瘦肉量会相应减少，所以与NaNO2的反应与对照组相比会减少，从而使得香肠的红度减小。此外，在芸豆蛋白改性的过程，改性采取的是超声辅助的糖基化改性方法，操作期间改性温度会使芸豆蛋白发生一定程度的褐变，使蛋白颜色变黄，从而使得添加改性芸豆蛋白香肠与纯肉香肠相比，红度相对较低，黄度则相对较高。这与Gnanasambandam R等人[30]研究的小麦麦芽蛋白在乳化香肠中应用时所产生的颜色变化一致。

2.8 蛋白添加量对香肠质构的影响

改性芸豆蛋白添加量对香肠质构的影响见表2。

由表2可知，改性芸豆蛋白量的增加，香肠弹性、硬度、内聚性、咀嚼性和回复性等指标均出现先增加后减少的趋势。在改性芸豆蛋白添加量为2%时，香肠的硬度、弹性、咀嚼性均达到最佳，分别为3.902×103±0.23a×103g，0.835±0.07a，3 728.013±138a，当改性芸豆蛋白在香肠中的添加量为3%时，内聚性、回复性达到最大值，分别为0.738±0.006a，0.351±0.009a。出现这种情况可能是蛋白质分子间的作用力增强造成的，随着改性芸豆蛋白添加量的逐渐增加，使得单位体积内的蛋白质分子增多，通过改性蛋白凝胶性网状结构，使肉糜中的水、脂肪、肌肉蛋白等物质形成了比较稳定的凝胶网状结构，油脂析出减少；但当蛋白添加量过多时，质构的各项指标数值减小，这可能与改性蛋白质的持水性有关[31]，香肠中较多的水分会减弱，因改性蛋白含量增加而使香肠体系凝胶效应增强的作用，从而使各项质构指标值有所降低。试验中质构所得数值与改性大豆蛋白加入到法兰克福香肠中的质构数值相比要略高一些[13]。由质构测定结果可知，添加改性芸豆蛋白后，香肠的质构优于未添加改性芸豆蛋白的香肠。说明改性芸豆蛋白添加到肉制品中的应用具有可行性。

表2 改性芸豆蛋白添加量对香肠质构的影响

3 结论

对糖基化改性芸豆蛋白的功能性质进行了测定，结果表明，糖基化改性增加了芸豆蛋白溶解性、乳化性、乳化稳定性和起泡性，降低了疏水性和起泡稳定性，使其更易于与食品体系融合。不同添加量的改性芸豆蛋白添加到猪肉香肠中，对香肠品质具有一定影响。结果表明，与纯肉香肠相比，蛋白得率和pH值会随改性蛋白添加量的增多而增大，香肠得率最大值为93.99%，pH值变化范围较小，当改性芸豆蛋白添加量为2%～3%时，香肠的质构达到最好；随着改性芸豆蛋白添加量的增加，香肠亮度和红度逐渐减小，黄度逐渐增大。综上所述，并结合实际得出，在改性芸豆蛋白的添加量为2%时，猪肉香肠的品质达到最佳，说明添加改性芸豆蛋白更有利于提高香肠的品质与风味，同时芸豆蛋白的营养与保健功能也能提升香肠的食用价值，且还可以降低香肠的生产成本。