老年原发性肝癌患者血清miRNA-200c水平及其与临床病理特征和预后的关系

殷焦 陈庆 李正平 杨林

(1湖北文理学院医学院分子医学中心，湖北 襄阳 441053；2中国人民解放军联勤保障部队第991医院)

原发性肝癌为世界6大恶性肿瘤之一，在各个年龄段均可发病，死亡率比较高；我国原发性肝癌也比较常见，其发病率和死亡率比较高〔1〕。原发性肝癌早期症状不明显，容易被忽视，多数原发性肝癌患者被发现时已经处于中晚期；原发性肝癌如果没有进行及时治疗，平均生存时间只有3个月左右〔2〕。近年来随着医疗水平的发展，使许多早期原发性肝癌患者被发现并进行了有效治疗，但因原发性肝癌容易复发和转移，因此预后仍不太乐观〔3〕。微小RNA(miRNA)调节翻译后基因表达，从而调控恶性肿瘤细胞的增殖分化和凋亡等过程〔4〕。miRNA的差异表达在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥关键作用〔5〕，miRNA-200c在多种恶性肿瘤中表达异常〔6，7〕。本文对老年原发性肝癌患者血清miRNA-200c水平进行研究，探讨其在老年原发性肝癌的发生发展、诊断、预后预测中的价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择90例老年原发性肝癌患者作为肝癌组，90例同期体检的健康老年人作为对照组。肝癌组年龄(75.43±4.16)岁；男58例，女32例；乙型肝炎病毒(HBV)阳性74例，阴性16例；有肝硬化77例，无肝硬化13例；肿瘤直径(3.67±1.02)cm；低分化25例，中分化29例，高分化36例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期22例，Ⅲ期33例，Ⅳ 期8例；有淋巴结转移36例，无淋巴结转移54例。对照组年龄(74.58±4.32)岁，男53例，女37例。对照组和肝癌组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经伦理委员会审批。纳入标准：肝癌组患者经病理证实为原发性肝癌，首次手术治疗，手术前未进行放化疗等其他治疗；对照组无肝病病史。排除标准：其他恶性肿瘤者，严重重要脏器功能障碍者，依从性差未正规随访者，失访者，资料不全者。

1.2血清miRNA-200c水平测定 肝癌组于术前抽取静脉血4 ml、对照组于体检当天抽取静脉血4 ml，根据RNA提取说明书提取总RNA，分光光度计测定RNA浓度和纯度，将提取的RNA反转录为cDNA，采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定血清miRNA-200c水平，以U6为内参，PCR条件为：95℃ 10 min；95℃ 15 s、56℃ 60 s，共42个循环。以2-ΔΔCt表示血清miRNA-200c水平。

1.3随访 采用门诊随访和电话随访，随访开始时间为手术时间，随访结束时间为死亡时间或随访截止时间，随访截止时间为2016年12月31日。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验，血清miRNA-200c水平对原发性肝癌的诊断价值采用受试者工作特征(ROC)曲线分析，血清miRNA-200c水平与预后的关系采用Kaplan-Meier法，取P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组血清miRNA-200c水平比较 肝癌组血清miRNA-200c水平明显低于对照组(0.57±0.08 vs 1.00±0.05,t=43.241,P=0.000)。

2.2血清miRNA-200c水平与原发性肝癌临床病理特征的关系 血清miRNA-200c水平与原发性肝癌的分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(均P<0.05)，其中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ 期、有淋巴结转移者血清miRNA-200c水平明显低于中-高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移者；血清miRNA-200c水平与原发性肝癌患者的年龄、性别、HBV感染、肝硬化、肿瘤直径无关(P>0.05)，见表1。

表1 血清miRNA-200c水平与原发性肝癌临床病理特征的关系

2.3血清miRNA-200c水平对原发性肝癌的诊断价值 血清miRNA-200c水平诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积为(AUC)为0.811，95%CI为0.808～0.814，诊断临界值为0.51，灵敏度为91.02%，特异度为69.53%。见图1。

2.4血清miRNA-200c水平与原发性肝癌患者生存期的关系 血清miRNA-200c水平以ROC曲线诊断临界值0.51为界，分为高表达组和低表达组，高表达组总生存率和无病生存率均明显高于低表达组(P<0.05)。见图2和图3。

图1 血清miRNA-200c水平诊断原发性肝癌的ROC曲线

图2 血清miRNA-200c与原发性肝癌总生存率的Kaplan-Meier曲线

图3 血清miRNA-200c与原发性肝癌无病生存率的Kaplan-Meier曲线

3 讨 论

原发性肺癌因缺乏敏感有效的诊断方法，致死率比较高〔8〕，因此寻找敏感有效的诊断方法具有重要意义。甲胎蛋白为比较常用的筛查原发性肝癌的肿瘤标志物，但仍存在许多缺陷，有大概1/3的早期原发性肝癌患者不能用甲胎蛋白检出，甲胎蛋白筛查原发性肝癌的灵敏性也不高。近年来，miRNA作为单链、小分子、非编码、内源性分子在恶性肿瘤的研究中广泛应用。miRNA为高度保守、内源性的一组小分子非编码RNA，长21～25个核苷酸，通过与mRNA的3′-UTR区域结合发挥对翻译过程的调节作用，从而参与细胞分化、增殖、凋亡等多种过程；从体液、器官、组织中提取的miRNA对温度、pH值、RNA酶活性均具有一定耐受性，该特性使其具有潜力成为多种疾病的生物标志物。miRNA与多种恶性肿瘤关系密切，多种恶性肿瘤组织中miRNA表达与正常组织存在差异；miRNA的异常表达参与恶性肿瘤的发生、发展过程，可能成为区分恶性肿瘤组织和正常组织的标志物〔9〕。miRNA在不同恶性肿瘤组织和正常组织中的表达具有组织特异性，使其成为恶性肿瘤临床诊断的潜在标志物〔10〕。多种miRNA在原发性肝癌中的表达也存在异常，在原发性肝癌的发生发展中发挥重要作用，为原发性肝癌诊断和预后评价的潜在生物标志物〔11〕；miRNA在健康人群和原发性肝癌患者血清中的表达也存在差异，因此血清miRNA水平也成为原发性肝癌诊断、术后复发、生存率预测的潜在标志物〔12，13〕。miRNA-200家族包括多个家族成员，miRNA-200c为miRNA-200家族成员之一，定位于人12号染色体上，在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔14～16〕，如miRNA-200c在Ⅲc期卵巢浆液性囊腺癌组织中表达升高，与卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力关系密切，临床上检测miRNA-200c对上皮性卵巢癌的进展及转移具有重要价值，过表达miRNA-200c有望成为治疗卵巢癌的手段之一〔17〕；miRNA-200c参与胰腺癌的上皮-间充质转化，影响人胰腺癌细胞的侵袭和迁移能力〔18〕；miR-200c通过P53/P21信号转导通路诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，逆转非小细胞肺癌细胞对甲氨蝶呤的耐药性〔19〕。来源于恶性肿瘤组织的miRNA可在血液中稳定存在，因此血清miRNA水平可反映其在恶性肿瘤组织中的表达，因恶性肿瘤组织受取材限制，而血清miRNA水平检测更为方便，因此研究血清miRNA水平的意义受到大家的青睐〔20〕。程佩宇等〔21〕研究发现结直肠癌患者血清 miRNA-200c水平降低，血清miRNA-200c水平与结直肠癌的分化程度、临床分期和淋巴结转移关系密切，血清miRNA-200c检测有望成为结直肠癌的诊断和预后判断的潜在生物标志物。本研究结果表明血清miRNA-200c在老年原发性肝癌的病情评估、诊断、判断预后中具有潜在价值，有望成为老年原发性肝癌的潜在生物标志物。