近平滑假丝酵母ATCC7330均质破碎工艺研究

王 伟，杨 锟，梅子龙，余华顺，戴秋红，任立伟，龚大春

（1.三峡大学湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制剂事业部，湖北 宜昌 443002）

0 引言

近平滑假丝酵母ATCC7330是一种具有优异生物氧化还原催化性能的酵母，广泛用于手性药物中间体的绿色催化合成中[1]。但整细胞催化时底物浓度较低，反应介质常常对细胞毒性较大，不利于工业化规模生产。因此，将近平滑假丝酵母破碎后获取重要的羰基还原酶，然后利用酶用于产业化生产中的生物催化合成具有非常重要意义。

酵母细胞壁较厚，难于破碎，必须采用外力或生物法才能使胞内物质得到释放。酵母细胞破碎的方法主要有物理破碎、化学破碎和生物酶法破碎等[2-5]。其中，物理破碎有超声波破碎、均质破碎、爆破破碎等方法；化学破碎要使用化学药剂，对于后处理加工带来比较大的麻烦；生物酶法破碎[3]是最近几年兴起的一种新的方法，效果比化学破壁好，但专用酶的成本较高，如果要获取的目标产物是胞内酶，必然会增加二次分离难度；而高压均质法物理破 碎[6-9]具有操作简单、处理量大、二次分离容易等优势，特别适用于工业化生产。

因此，试验选用高压均质物理方法对近平滑假丝酵母进行破碎研究，考查了酵母质量分数、均质压力、均质时间和均质次数等对分离酮基还原酶的效果影响，以期获得比较好的粗酶初步分离方法，为酮基还原酶的进一步纯化奠定基础。

1 材料与设备

1.1 试剂

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；蔗糖、乳糖、木糖，天津科密欧化学试剂有限公司提供。所有化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

JN-minBC型超高压纳米均质机，广东聚能纳米生物科技股份有限公司产品。

1.3 菌株和培养基

近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）ATCC7330，实验室保藏；斜面保藏培养基：蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂20 g/L；种子培养基：蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L。

2 试验方法

2.1 近平滑假丝酵母ATCC7330的制备

参考文献[1]的方法，利用最优条件下最优培养基配方和工艺：蔗糖34.64 g/L，(NH4)2HPO416 g/L，硫酸镁0.80 g/L，酵母浸粉6.0 g/L；最佳培养初始pH值5.0，最佳通风量3.0 L/min，培养近平滑假丝酵母ATCC7330，离心收集菌体。

2.2 高压均质破碎操作

（1）接通总电源，整机通电。将钥匙插入工作/锁定转换孔，并旋到工作位置。

（2）进样杯中加满纯净水或缓冲液，按“液压泵”“开”按钮（绿色），油泵启动，供油压力输入主附油缸。

（3）按“主机”“开”按钮，机器正常运转（往复运动）。

（4）顺时针缓慢调节调压阀，使低压表、高压表的压力同步上升，根据样品种类，需用不同的破碎压力（200 MPa以下）进行试验。

（5）添加不同质量分数的酵母缓冲液到达进样杯颈部时，按“主机”“关”按钮，机器停止运转。将待破碎样品加入进样杯中，按“主机”“开”按钮，细胞破碎开始。经均质阀破碎后的样品，沿循环冷却管路冷却后，从出样口流出，样品一次破碎完成（可根据需要进行多次破碎）。

（6）样品破碎完后，逆时针调节调压阀，使右边低压表至“0”位，加入纯净水或75%酒精进行清洗，直至出样清澈。

（7）按左边红色“主机”“关”按钮，再按右边红色“液压泵”“关”按钮；逆时针打开卸压阀，使高压表回“0”位。卸压完毕后，立即顺时针关上卸压阀。

（8）关掉总电源，拔掉电源线。

2.3 酮基还原酶酶活的测定

酶活定义为1 min内消耗1μMNAD(P)H所需要的酶量为一个酶活单位。

基本步骤：将缓冲液、底物和辅酶依次加入后于30℃下保温2 min，加入适量酶液后读取1 min内的于波长340 nm处吸光度的下降值。

反应体系：700μLpH值7.5的PB缓冲液，浓度为30 mmol/L的底物100μL，浓度为2 mmol/L的NAD(P)H，酶液100μL。

2.4 正交试验设计

在单因素试验基础上，选定均质温度、酵母质量分数、均质压力和均质次数作为4个因素，在3个水平上进行设计，测定粗酶液酶活，用于正交设计分析。

近平滑假丝酵母ATCC7330高压均质破碎因素与水平设计见表1。

表1 近平滑假丝酵母ATCC7330高压均质破碎因素与水平设计

3 结果与分析

3.1 近平滑假丝酵母ATCC7330均质破碎正交试验粗酶液酶活分析

根据单因素试验表明，温度高对于细胞破碎是有利的，但是温度太高，容易导致酶失活，不利于粗酶的提取。因此，选用4～8℃作为优化范围。均质进料的酵母质量分数对于均质液的黏度会产生较大影响，因此通过单因素试验选取了10%～20%的质量分数。均质压力对于酵母细胞破壁会产生较大冲击力，对酵母的破碎率是正相关的，因此压力的选取至关重要，但设备的最高压力为200 MPa，因此选用了100～180 MPa的范围进行试验。均质次数是根据一次均质的效果来确定的。由于均质操作速度快，一次破壁效果不一定好，因此采用2.4的正交设计表进行9次试验。

近平滑假丝酵母ATCC7330均质破碎正交试验均值和极差见表2。

3.2 近平滑假丝酵母ATCC7330均质破碎最优条件确定与验证

通过9次试验，利用正交设计软件极差分析可以看出，均质温度、酵母质量分数、均质压力和均质次数4个因素中对酵母近平滑假丝酵母破碎提取酮基还原酶粗酶液的影响依次为均质压力＞酵母质量分数＞均质温度＞均质次数。通过正交设计软件均值分析可以看出，酵母近平滑假丝酵母破碎提取酮基还原酶的粗酶液的最佳工艺条件为均质温度6℃，酵母质量分数20%，均质压力180 MPa，均质次数为3次。经过验证试验，可以得到粗酶液酶活1.572 U/mL，比优化前提高19%。

表2 近平滑假丝酵母ATCC7330均质破碎正交试验均值和极差

3.3 近平滑假丝酵母破碎显著性因素分析

通过正交试验软件分析，在a=0.10条件下，均值温度、酵母质量分数、均质压力和均质次数4个因素对酵母近平滑假丝酵母均质破碎提取酮基还原酶的粗酶液具有显著性影响的是均质压力，所以在均质机压力允许的条件下，尽可能控制在较高压力。通过优化选取180 MPa为宜。

近平滑假丝酵母ATCC7330高压均质破碎正交试验方差分析见表3。

表3 近平滑假丝酵母ATCC7330高压均质破碎正交试验方差分析

4 结论

通过正交试验设计，考查了均质温度、酵母质量分数、均质压力和均质次数对酵母近平滑假丝酵母均质破碎提取酮基还原酶的粗酶液效率的影响，得出4个因素的影响大小为均质压力＞酵母质量分数＞均质温度＞均质次数，其中均质压力为近平滑假丝酵母破碎的显著性因素，最佳破碎工艺为均值温度6℃，酵母质量分数20%，均质压力180 MPa，均质次数为3次。经过验证试验，可以得到粗酶液酶活1.572 U/mL，比优化前提高150%以上。