马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶INU1的晶体结构研究

李 龙，苏晓琴，方自安，周峻岗，胡小健，吕 红

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438； 2.上海工业微生物工程技术研究中心，上海 200438)

菊粉(Inulin)是一种主要由β-D-呋喃果糖残基通过β(2→1)键连接的多糖聚合物，其末端通常为葡萄糖.它存在于多种植物中，特别是在根或根茎中含量丰富，在植物根的干粉中菊粉的净含量甚至超过70%[1].由于来源丰富，菊粉作为原材料被广泛应用于高果糖浆的工业生产，它也可作为碳源生产乙醇等生物燃料以及作为动物饲料添加剂[2-4].

菊粉酶(Inulinase)又称为2，1-β-D-果聚糖果糖水解酶，可以将菊粉水解成果糖和低聚果糖，它广泛存在于酵母菌、曲霉和一些其他微生物中.菊粉酶可作为工业酶应用于食品工业中高果糖浆、低聚果糖和多聚果糖的生产[2，5-7]，也有一些报道将菊粉酶应用于乙醇的生产[8-10].酵母菌具有繁殖周期短、易于大规模培养以及生物安全性高等特点，从而成一种工业化生产菊粉酶的良好来源[11-12].其中，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)由于耐热性好、产生的菊粉酶活力高和表达稳定等特点而得到了广泛的使用[12-14].

按照菊粉酶的反应类型，菊粉酶被分为外切菊粉酶(E.C.3.8.1.80)和内切菊粉酶(E.C.3.2.1.7).其中外切菊粉酶水解菊粉末端的果糖单元，内切菊粉酶则将菊粉断裂为菊粉寡糖.前者能够用于生产高果糖浆，后者用于生产不同聚合长度的菊粉寡糖[13，15].在1991年，Laloux等人克隆和表达了来源于K.marxianusATCC12424菌株的第一个外切菊粉酶基因INU1[16].为了深入研究马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶INU1的结构和功能，我们在前期研究[15]的基础上构建了马克斯克鲁维酵母INU1的表达质粒，并在毕赤酵母中进行分泌表达，之后通过阴离子交换层析获得了纯化的INU1菊粉酶，成功结晶后我们解析得到了分辨率为2.8Å的INU1晶体结构.对该晶体结构的解析和分析，将帮助我们确定催化反应的关键氨基酸以及为后续的酶学改造提供基础.

1 材料与方法

1.1 表达载体的构建

以含INU1基因(GenBank: X68479.1)的原始质粒CB104为模板，通过PCR扩增DNA并在基因的5’端和3’端分别引入SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，上游引物序列为5’-GACCTACGTAATGAAGTTCG-CATACTCCCTCTTGC-3’，下游引物序列为5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAACGTTAAATTGG-GTAACGTTAAAT-3’.PCR产物通过1%琼脂糖核酸电泳进行鉴定，然后通过DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)纯化.纯化后的PCR产物以及pPIC9毕赤酵母蛋白表达载体(Invitrogen公司)，两者经限制性内切酶SnaBⅠ和NotⅠ(TaKaRa公司)双酶切消化后进行连接反应，得到的重组质粒pPIC9-INU1以核酸测序的方法验证.

1.2 外切菊粉酶INU1的表达、活性检测与纯化

测序成功的重组质粒pPIC9-INU1使用SalⅠ线性化后，通过电穿孔的方式(Eppendorf，电穿孔仪2510)转化到毕赤酵母SMD1168(his4，pep4)菌株(Invitrogen，131020sa)中.通过平板筛选后挑取单菌落，于5mL YPD液体培养基中振荡培养(200r/min、30℃)至OD600为2～6后，3000r/min、5min离心收集菌体.菌体重悬于50mL BMMOL/LY培养基，每24h加入终浓度为1%的无水甲醇诱导72h后，10000×g、15min收集培养上清液，收集的上清液在透析缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，pH 8.0)中透析4次，每次4h.

取0.5mL透析后的发酵上清液，与2.5mL 5%(质量浓度)的菊粉混合，在0.05mol/L醋酸缓冲液pH4.7中50℃温浴5min，反应后释放的果糖或葡萄糖使用DNS比色法进行定量[17].酶活定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(U).

INU1可以使用阴离子交换柱进行纯化，首先使用平衡缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，pH8.0)平衡HiTrap Q HP柱(GE公司)，然后将蛋白低速流过结合在Q柱上，最后用洗脱缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH8.0)和洗脱缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，pH8.0)梯度洗脱蛋白.以上各组分，以12%的SDS-PAGE胶鉴定蛋白表达和纯化情况.

以截留分子量为30kDa的超滤管(Millipore公司)将纯化后的蛋白洗脱液浓缩，并换液至20mmol/L Hepes pH7.2、200mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和5%甘油的缓冲液中进行结晶筛选.

1.3 结晶与数据收集和结构解析

在20℃培养条件下，使用Crystal Screen、Crystal Screen 2和PEG/Ion Screen晶体筛选试剂盒(Hampton research公司)进行结晶初筛，之后使用24孔板悬滴法对初筛得到的结晶条件进行重复和优化.INU1菊粉酶的晶体衍射数据于中国科学院上海同步辐射中心(SSRF)BL17U线站收集[18]，衍射数据经HKL2000[18]进行整合处理，之后使用分子置换方法进行结构解析，结构的解析优化使用CCP4、Coot等软件[19-20]，所有结构示意图通过Pymol软件(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC)制作.INU1的结构数据已上传到蛋白质结构数据库(PDB序列号8J0T).

2 结果与分析

2.1 外切菊粉酶INU1的纯化和结晶

通过毕赤酵母SMD1168(his4，pep4)分泌表达的INU1显示出很高的酶活，在pH4.7的缓冲液中50℃条件下，INU1的酶活可以达到1671U/mL，比通过毕赤酵母GS115表达的外切菊粉酶活性要高得多[21-22].经阴离子交换层析能获得高纯度的INU1蛋白，在SDS-PAGE胶上的蛋白条带位置与INU1的理论分子量62kDa一致(图1(a)，@@@484页）.蛋白样品浓缩至10mg/mL进行结晶筛选，初筛时在18%PEG4000、0.1mol/L二甲胂酸钠pH 6.0、0.2mol/L MgCl2条件下获得了INU1晶体.通过24孔板悬滴法进行重复优化(1μL蛋白溶液和1μL沉淀剂溶液混合、1mL的池液)并在1周后获得长条状三维蛋白晶体，其尺寸为5mm×0.3mm×0.3mm(图1(b)，@@@484页）.晶体浸泡在防冻液(20%PEG4000、0.1mol/L二甲胂酸钠、0.1mol/L MgCl2和20%甘油，pH6.0)约30s后，速冻于液氮中.

图1 菊粉酶INU1的纯化和结晶Fig.1 Thepurification and crystallization of inulinase INU1(a)为纯化的SDS-PAGE胶图.其中M条带为蛋白分子量标准，S为毕赤酵母分泌表达的上清，P为表达后的沉淀，L为HiTrap Q HP的上样样品，F为未结合Q柱的流穿液.(b)为优化后的INU1晶体.

2.2 外切菊粉酶INU1的整体结构

INU1晶体的衍射数据于中国科学院上海同步辐射光源(SSRF)BL17U线站收集，使用的X射线波长为1.0082Å，曝光时间为1s，温度为100K，晶体旋转步长为0.5°，共收集旋转100°的衍射图谱数据.

INU1晶体空间群为I4122，晶胞参数a=b=c=172.65Å，Matthews系数为2.61Å3/D，溶剂含量为52.82%.用于收集衍射数据的INU1晶体质量较高，其镶嵌度为0.62，分辨率达到了2.80Å，收集的衍射数据有99.86%的完整性，Rmerge为9.8%(表1).

表1 INU1的晶体学参数表

*括号中为最高分辨率外壳层的值.

以氨基酸序列同一性为52%的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)转化酶(PDB ID 4EQV)晶体结构作为模板，使用分子置换法我们完成了INU1的晶体结构解析.完成晶体结构优化后的Rcrystal和Rfree值分别为0.20和0.27，平均B因子为50.12Å2，拉氏图(Ramachandran plot)分析显示最后的结构模型中99.9%的氨基酸的二面角都处于最优或允许的区间.

晶体结构显示在每个不对称单元中有两个INU1蛋白分子面对面形成一个二聚体的堆积方式(图2(b)).这两条链的结构基本一致，把两条链根据二级结构进行叠合时显示Cα原子的均方根偏差为0.356Å.计算两个分子的表面积为34400Å2，相互作用界面包埋的相互作用面积为6585.6Å2，标准的解离自由能约为17kcal/mol，提示晶体中显示的这个二聚体在溶液中也是一个非常稳定的聚合状态，这与GH32家族中其他糖苷水解酶的二聚化一致.在这个晶体结构中，还确定了20个结合的水分子，在每条链的Asn226还结合了两个以β(1→4)糖苷键联接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)分子(图2(a)).

INU1共有555个氨基酸残基，其中N端1～16号氨基酸为信号肽，17～23号氨基酸为前肽区.在晶体结构中，除了N端前面的32个氨基酸和第252位到262位的一个环结构，其他氨基酸都能根据电子云密度清楚地确定位置.INU1的单体由两个结构域组成: N端高度保守的β螺旋桨结构域，由5个典型的β折叠叶片(Ⅰ～Ⅴ)组成，而C端较不保守的β夹层结构域包括12个β折叠片层(图2(c)).

INU1属于糖苷水解酶32家族(Glycoside Hydrolase Family 32, GH32)(图3).根据氨基酸序列相似性糖苷水解酶的可分为156个家族，GH32家族主要包括转化酶(EC 3.2.1.26)、内切菊粉酶(EC 3.2.1.7)、左旋糖苷酶(EC 3.2.1.65)和外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)等.该家族在结构上的主要特点就是具有保守的5叶片β螺旋结构域[23].INU1的晶体结构也与GH32家族成员基本一致，与其他GH32家族成员的二级结构叠合对比显示Cα原子的均方根偏差范围为1.35～1.55Å(图2(d)).

图2 INU1的晶体结构Fig.2 The crystal structure of inulinase INU1(a)为INU1晶体的衍射图；(b)非对称单位中两个INU1分子形成二聚体，分别为黄色和绿色显示.图中N-term和C-term标示了每条链的N端和C端.每条链的Asn226结合有两个以β(1→4)糖苷键联接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)分子，显示为青色；(c)为单个INU1分子结构域；(d)为INU1与其他GH32家族蛋白结构的比对.图中的PDB序列号3U75为西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)呋喃果糖苷酶，3KF5为S.occidentalis转化酶，4EQV为S.cerevisiae转化酶，1Y9M为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)外切菊粉酶，3SC7为无花果曲霉(Aspergillus ficuum)内切菊粉酶.

图3 INU1与呋喃果糖苷酶底物结合口袋的结构比对立体视图Fig.3 The cross-eye stereo view of the substrate binding pocket in INU1 and fructofuranosidase from S. occidentalis图中INU1显示为黄色，西方许旺酵母来源的呋喃果糖苷酶(PDB序列号3U15)显示为绿色，由6个果糖形成的菊粉分子显示为青色.图中还标示出了底物结合口袋周围的重要氨基酸，氨基酸位置以INU1序列为参照.

3 讨 论

我们尝试在结晶条件中添加果糖和菊粉，但未能获得INU1与底物的复合物结构.在西方许旺酵母来源的呋喃果糖苷酶中，有结合底物菊粉的复合物晶体结构[24].将INU1与该结构对比显示，在底物结合口袋中与底物相互作用的氨基酸都是保守的(图3，@@@486页）.糖苷水解酶32家族的催化反应一般由Blade Ⅰ结构β1上的一个天冬氨酸或谷氨酸作为亲核试剂，Blade Ⅲ结构β9上高度保守的Arg-Asp-Pro(RDP)基序起到稳定催化过程中间态的作用，Blade Ⅳ结构β13上的谷氨酸作为质子供体(图4，@@@486页）[25-27].根据序列和结构对比结果，外切菊粉酶INU1的Asp53、Asp182和Glu238应为主要的催化氨基酸，还有Asn52、Gln71、Trp79、Phe113、Ser114、Arg181、Asn273、Pro274和Trp335为与底物相互作用的氨基酸，其中Trp79、Phe113、Pro274和Trp335为提供疏水作用的氨基酸(图3和图4).

图4 INU1与其他GH32家族蛋白氨基酸序列比对Fig.4 The amino acid sequence alignment of INU1 and others GH32 family proteins图中黑色三角形为催化氨基酸，黑色圆圈为与底物有亲水相互作用的氨基酸.

我们尝试在结晶时加入菊粉作为底物，但在活性中心位置没有找到明显的底物或产物分子的电子云密度信号.另外可能由于构象不固定，在INU1结构靠近糖基化基团Asn226附近的第252到262位的一段环状结构没有清晰的电子云密度.在这一区域附近，还有一些难以辨认的电子云密度信号，它们可能是较长的糖链分子，也可能是非特异结合的菊粉分子.