低能N+离子注入诱变选育金耳多糖高产菌株的研究

蒋 益 郑惠华 刘广建* 薛 璟 季宏更 张 蕾

（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214063；2江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通226009）

金耳（Tremella aurantialba）为食药用菌中的珍稀品种之一，又称黄木耳，隶属担子菌亚门、层菌纲、银耳目、银耳科、银耳属。金耳多糖是金耳的重要化学成分之一，研究证实金耳多糖具有调节机体免疫能力、抑制肿瘤、降血糖、降血脂的作用，同时在抗溃疡、抗氧化、保肝、抗辐射、抗炎等方面具有良好的保健功效[1]。金耳子实体是由外层的金耳和内层的毛韧革菌组成的异质复合体，我国从20世纪80年代开始分离驯化金耳菌种，由于金耳寄生的特殊性及栽培的需求，目前金耳菌种多数为复合菌株[2]，用于液体发酵的纯金耳菌种稀缺，因此，金耳菌种选育方面的研究显得尤为重要。在潮湿的条件下，金耳成熟的担孢子不容易发芽产生芽管，但容易似酵母菌那样以芽殖方式产生大量酵母状的分生孢子，这种分生孢子能像酵母菌那样，以芽殖的方式再产生大量酵母状的芽孢，使分生孢子的数量不断增多[3]，这种生长速度快的酵母状分生孢子是诱变的理想材料。离子注入微生物是通过离子注入诱变出发菌株，通过对目标性状的生物效应分析，筛选获得高产、高效的突变菌株[4]。此方法在金耳人工诱变育种中尚未见报道，笔者进行了低能氮离子注入诱变选育金耳的试验，旨在为金耳选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试金耳菌株:金耳酵母状分生孢子菌株TA08，由江苏省苏微微生物研究有限公司分离得到，改良PDA培养基4℃保存。

培养基:改良PDA培养基为马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，加水1000 mL，琼脂粉20 g，pH自然。金耳液体培养基为蔗糖10 g，葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，加水1000 mL，pH自然。发酵培养基为玉米粉30 g，豆饼粉10 g，蔗糖5 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，加水1000 mL，pH自然。

主要设备:LZD-900型离子注入机（南京工业大学生物工程中心）。

1.2 试验方法

1.2.1 低能N+离子注入诱变

1.2.1.1 离子注入前处理

将金耳TA08接种于金耳液体培养基中，150 r∕min，25 ℃摇床培养2 d，然后用无菌水调整成浓度为105个∕mL级的金耳酵母状孢子悬液。吸取0.1 mL的孢子悬液于无菌空培养皿中，于超净工作台中快速涂匀风干，立即注入低能氮离子。

1.2.1.2 低能N+离子注入

低能N+离子注入前，LZD-900型离子注入机开机预热2 h，用紫外线对靶室持续消毒30 min，调节靶室真空度为10-3Pa，注入物质N+提前加速到20 KeV，对样品注入剂量分别为10×1014、20×1014、30×1014、60×1014、80×1014、100×1014、120×1014ions∕cm2。试验组采用间歇式脉冲注入低能N+离子，连续注入5 s后间隔15 s，对照组置于靶室真空中，不注入低能N+离子。每个处理设3个重复。

1.2.2 存活率统计

将经过氮离子注入的培养皿和对照处理（仅抽真空而没有离子注入）的培养皿用1 mL无菌水洗脱，取0.1 mL涂布于金耳固体培养基平板上，25℃避光培养4 d后计数，然后以注入剂量为横坐标，存活率为纵坐标，绘制金耳在不同剂量的N+离子注入下的存活率曲线。

存活率=某剂量下离子注入组菌落数∕对照组平板上生长的菌落数×100%

1.2.3 低能N+离子注入对金耳菌株突变率的影响

以出发菌株作为对照，随机挑取接受离子注入诱变后形成的菌落分别进行液体发酵试验，每个剂量挑取30个菌株，考察菌株的多糖产量。高于对照5%以上的为正突变，低于对照5%以上的为负突变，正突变的菌株数占所取菌株总数的比值为正突变率，负突变的菌株数占所取菌株总数的比值为负突变率。

1.2.4 诱变金耳菌株的筛选

1.2.4.1 初筛

将经离子束注入后的培养皿用1 mL无菌水洗脱，取0.1 mL涂布于固体平板上，待菌落长成后，挑取生长较快、菌落较大的保存于试管中。根据以上步骤2最终确定的剂量，选择该剂量下保存的菌株，接种于金耳液体培养基，150 r∕min，25℃，摇床培养3 d后，再按5%接种量与出发菌株同步接种到金耳液体培养基摇床培养，150 r∕min，25℃培养4 d后用血球计数法统计酵母状孢子数量。

1.2.4.2 复筛

将初筛得到的优势菌株接种于金耳液体培养基中，150 r∕min，25 ℃，摇床培养3 d后，按5%接种量与出发菌株同步接种到发酵培养基中，与出发菌株同时进行液体发酵。测定多糖产量，选择多糖产量高于对照菌株5%以上的菌株作为复筛后的诱变高产菌株。

1.2.4.3 多糖测定

发酵结束后，将发酵液（包含菌体）收集后，超声30 min，而后煮沸处理2 h，离心收集上清后残渣加等体积水继续煮沸2 h，合并两次提取液，浓缩至原体积1∕5，加入4倍体积的无水乙醇静置沉淀，后采用硫酸-蒽酮法[5]测定多糖含量，再计算多糖产量。

1.2.5 遗传稳定性试验

对筛选所得的优势诱变菌株进行发酵性能稳定性试验。诱变菌株连续传代20代，取第10代和20代发酵，测定生物量和多糖产量，与第一代比较，选择多糖产量稳定、性状无变化的菌株作为最终的诱变多糖高产金耳菌株。

2 结果与分析

2.1 低能N+离子注入诱变对存活率的影响

不同N+注入剂量下金耳的存活率曲线（图1）显示，在注入剂量10×1014～120×1014ions∕cm2，随着注入剂量的增加，存活率呈现先降低、后升高再降低的“马鞍型”变化趋势。可能是由于低剂量离子注入细胞的射程较短，离子只对细胞表面造成损伤和刻蚀，因而存活率较高；随着注入剂量的增加，细胞表面的刻蚀严重，离子损及细胞内部并产生大量的自由基等，致使存活率急剧下降；但下降到一定值时出现饱和现象，当剂量累积到一定值时，细胞某种修复机制被激活，存活率有所回升；当剂量继续增加时，细胞损伤将无法修复，存活率继续下降。研究发现，在“马鞍型”区域菌株最容易出现较高的正突变。

图1 不同N+离子注入剂量下金耳的存活率曲线

2.2 低能N+离子注入对菌株突变率的影响

图2 不同N+离子注入剂量对金耳突变率的影响

在低能N+离子注入剂量60×l014～80×1014ions∕cm2内正突变率较高，在剂量 60×l014ions∕cm2时，正突变率最高（图2）。有研究表明，当诱变致死率达70%～80%时，产生较高的正突变，试验中正突变占优势的注入剂量范围正对应存活率19.3%～26.2%的曲线段（图1），综合图1及图2的结果，低能N+离子注入最适诱变剂量为 60×l014ions∕cm2。

2.3 诱变菌株的筛选结果

2.3.1 初筛

选择60×l014ions∕cm2注入剂量下的诱变菌株进行初筛，选取生长快、菌落大的单菌落与出发菌株（TA08）进行液体发酵，结果筛选到29株孢子量高于对照5%的菌株，部分菌株（前9位）结果见表1。其 中 菌 株 TAY6034、TAY6042、TAY60104、TAY60108、TAY6048、TAY6098具有较高的产量，较出发菌株TA08均有20%以上的提升，而4 d内生长速度最快的为TAY6048。

表1 诱变菌株的初筛结果

2.3.2 复筛

对初筛菌丝量前9的优势菌株进行复筛，以多糖产量为考察依据，筛选得到多糖产量高于对照菌株5%的有5株，其中3株优势菌株TAY60104、TAY6048、TAY6098（图 3），其多糖产量分别为2.55 g∕L，2.66 g∕L，2.58 g∕L，比出发菌株分别提高了7.59%，12.34%，8.87%。

图3 诱变菌株的复筛结果

2.4 遗传稳定性试验

将复筛所得3株优势菌株与对照菌株一起进行遗传稳定性试验，结果见表2。由表2可知，多次传代后菌株TAY60104多糖产量下降较明显，菌株TAY6048与TAY6098从初代到20代，多糖产量变化不大，其中TAY6048产量稳定，基本上维持在2.7 g∕L左右，说明其遗传稳定性较好，故选定其为适宜于液体发酵的金耳多糖高产菌株。

表2 诱变菌株的遗传稳定性

3 小结与讨论

经过多年的研究实践，食用菌菌种选育己从最初的选择育种、杂交育种发展到物理化学诱变、原生质体融合育种以及运用分子生物学技术进行育种等[6]，但目前金耳的诱变选育研究开展较少。离子注入技术是我国自主研发且具有独立知识产权的技术，以其独特的诱变机理和较显著的生物学效应受到广泛关注，离子注入的能量、剂量、脉冲次数等参数可以按需要进行不同组合，这种联合作用不但使诱变具有较高的方向性和可控性，还可使产生的生物学效应比单一辐射更为丰富，为筛选有利的突变型提供了较大空间[7]。该技术在食药用真菌诱变中已有应用。汪维云[8]采用20×1013～100×1013ion∕cm2剂量的 N+离子注入灰树花菌株，发现注入剂量在 40×1013～60×1013ion∕cm2时，能促进其菌体生长、提高纤维素酶活性，同时提高多糖产量，并用纸层析和GC法对离子注入处理和对照菌的产物进行比较鉴定，结果显示多糖性质与结构一致。凡启超[9]采用低能氮离子束注入松乳菇，筛选到诱变菌株Ld-135，其液体发酵生物量为1.24 g∕100 mL，胞内多糖的含量为1.27%，粗蛋白含量为26.13%，较出发菌株均具有显著性提高。董先茹等[10]采用氮离子束诱变蟹味菇菌株，筛选出了相对于出发菌株麦角甾醇显著提高的突变菌株X-004，其菌盖中麦角甾醇含量为 4.228 mg∕g，菌柄中为1.690 mg∕g，蛋白质和粗纤维含量分别达到35.41%和23.29%。

金耳子实体是由外层的金耳和内层的毛韧革菌组成的异质复合体，金耳菌丝的生长必须借助于有亲和性的伴生菌（毛韧革菌）菌丝体的帮助，才能正常地生长发育。用金耳子实体提取或混合菌株发酵生产的金耳多糖已少量投放市场，但由于金耳菌种寄生的这种特殊性，固体栽培金耳子实体产量小，周期长，易受季节影响以及病虫害侵袭，没有足够的金耳子实体进行工业化生产；而用混合菌株发酵时，条件不同导致金耳菌和毛韧革菌消长也会不同，常常粗毛韧革菌占优势，金耳少，所获得二次代谢物的多糖有差异，产量与品质不稳定。因而可以利用金耳酵母状分生孢子发酵生产多糖，在适宜条件下得到恒定的多糖成分。笔者采用氮离子注入技术对金耳进行诱变，提高了诱变的效率和正突变的概率，经不同剂量的氮离子注入后，在最适剂量 60×1014ions∕cm2下，筛选到一株遗传性状稳定的金耳新菌株，其液体发酵多糖产量远高于出发菌株，且诱变后的金耳菌株不易发生退化，遗传性状稳定，填补了金耳菌种诱变方面的空白，为金耳多糖的生产提供了一种新的高效高产菌株。