乏氧环境下TIGAR 线粒体定位介导食管癌乏氧辐射抵抗

姚奇伟 吴海山 黄志宇 李建成

食管癌是常见的消化道肿瘤，其发病率和死亡率位居我国恶性肿瘤的第4位[1]。放疗是食管癌治疗的重要手段之一，但放射治疗及各种增敏方法效果不理想[2-3]。目前研究发现大多数实体瘤能产生乏氧区域，局部乏氧作为一个重要的肿瘤微环境特征，被认为是导致肿瘤放疗抵抗最为关键的因素[4-6]。TIGAR，即TP53 诱导的糖酵解及凋亡调节蛋白，是p53蛋白下游调节细胞葡萄糖代谢的重要蛋白，与多种实体肿瘤的发生、发展密切相关[7-9]。然而对于TIGAR与乏氧食管癌细胞辐射敏感性的研究，目前尚未见国内外报道，因此，本实验研究了乏氧对人食管癌细胞TIGAR 线粒体定位的作用，以及TIGAR 线粒体定位对其放射敏感性的影响。以期更全面地阐明食管癌乏氧放疗抵抗的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

食管癌细胞（ECA109、KYSE410、KYSE450）购自中科院上海细胞库。细胞线粒体分离试剂盒、活性氧检测试剂盒购于上海碧云天公司；慢病毒包装由上海吉凯基因合成；抗体购于美国CST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人食管癌细胞常规培养于含10%FBS的 RPMI1640 培养基，37℃、5%CO2浓度下，于恒温恒湿培养箱中培养。

1.2.2 Western blot检测蛋白表达 提取细胞全蛋白及线粒体：用RIPA裂解细胞，4℃下高速离心取上清液，采用BCA蛋白测定蛋白浓度后蛋白变性。提取线粒体蛋白采用细胞线粒体分离试剂盒提取。采用SDS-PAGE进行蛋白质电泳分离蛋白，湿法转膜转印至PVDF膜上，室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光试剂显色，于暗室中压片，洗片，晾干，扫描仪扫描图像。

1.2.3 细胞乏氧及辐射 细胞培养于Thermo厌氧培养箱（氧浓度1%）20 h后，将培养板置于医用直线加速器下，采用6MV-X射线照射，剂量率350 cGy/min，SSD=100 cm，照射野40×40 cm。

1.2.4 克隆形成实验检测食管鳞癌细胞增殖情况 计算不同照射剂量组的细胞克隆形成率和存活分数。运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合，模型公式为：SF=1-（1-e-D/D0）N。

1.2.5 统计分析 使用SPSS 22.0版本统计软件进行统计分析，采用t检验分析相关实验结果，P＜0.05，差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 不同食管癌细胞内TIGAR的线粒体定位水平

不同食管癌细胞（ECA109、KYSE410、KYSE450）分别提取细胞总蛋白及线粒体蛋白进行Western blot（WB）分析，结果显示KYSE410细胞中TIGAR在线粒体中的表达最高，KYSE450细胞最低（图1）。

2.2 乏氧诱导食管癌细胞TIGAR的线粒体定位：

WB检测乏氧及常氧环境下TIGAR在细胞及线粒体内表达，结果显示在乏氧培养条件下，食管癌细胞中TIGAR在线粒体中的表达升高（图2）。

2.3 研究调控TIGAR线粒体定位对乏氧食管癌细胞辐射敏感性的影响

图1 WB 检测不同食管癌细胞中TIGAR 在线粒体及全细胞中的表达量

包装慢病毒，在KYSE410细胞中敲除TIGAR以及在KYSE450细胞中过表达TIGAR。结果显示敲除TIGA降低了TIGAR的线粒体定位水平（图3A）；而过表达TIGAR提高了TIGAR的线粒体定位水平（图3B）。克隆形成实验显示在干扰KYSE410细胞TIGAR表达后，细胞在乏氧条件下的辐射敏感性增加（图3C）。而在KYSE450细胞过表达TIGAR后，细胞在乏氧条件下辐射敏感性降低（图3D）。

图2 WB 检测TIGAR 在乏氧条件下线粒体及全细胞中的表达量

图3 A、B WB 检测干扰及过表达TIGAR 后其线粒体定位水平的变化；C、D 克隆形成实验验证在调控TIGAR 后，细胞在乏氧条件下辐射敏感性的变化

3 讨论

食管癌是全球较常见恶性肿瘤之一。在我国，其发病率和癌症死亡率均居我国消化道肿瘤第2位[1]。作为目前的研究热点，肿瘤微环境被发现在肿瘤发生、发展以及治疗抵抗的过程中都发挥着重要作用。研究显示大多数实体瘤能产生乏氧区域，而乏氧可以造成肿瘤对放射治疗产生抵抗[4]。目前关于如何克服肿瘤乏氧辐射抵抗，仍没有很好的方法。我们的研究围绕食管癌乏氧辐射抵抗展开，揭示了食管癌乏氧辐射抵抗的新机制，为临床克服食管癌乏氧辐射抵抗提供了新思路及相关实验基础。

TIGAR受P53诱导，TIGAR能促进细胞的氧化磷酸化，最终导致细胞中ROS产生减少。已发现TIGAR在多种肿瘤组织高表达的现象.提示了TIGAR与肿瘤的发生、发展存在着紧密的联系[10-11]。

我们在本项研究中发现乏氧情况下TIGAR在线粒体中的定位增高。其机制目前尚不明确。研究显示乏氧条件下TIGAR的线粒体定位依赖于乏氧诱导因子1α的激活[12]。因此我们考虑食管癌乏氧介导的TIGAR的线粒体定位，也可能位依赖于乏氧诱导因子1α等关键因子及信号通路的激活。

TIGAR与多种肿瘤的发生、发展密切相关，本研究通过干预TIGAR 线粒体定位逆转乏氧食管癌细胞的辐射抗性，进一步为食管癌放疗增敏提供实验依据。

4 结论

本研究显示乏氧可以诱导食管鳞癌细胞中的TIGAR线粒体定位，从而介导食管癌乏氧辐射抵抗。