心肌细胞培养进展

李攀阳 王凌霄 高丽 赵婷婷 宋爽

【摘 要】为进一步提高我国心血管疾病的治疗效果和研究效果，医学界已经加强了对心肌细胞的培养工作，也广泛应用在我国心血管疾病防治研究领域。对于相关科学研究进展来说，成功培养心肌细胞对其具有重要的影响，而且目前经济细胞培养的技术也得到了广泛关注。现如今，国内外对于培养心肌细胞的研究比较多，本文主要针对心肌细胞培养进展进行了分析和探讨。

【关键词】心肌细胞;培养;进展

在全世界范围内心脏疾病的发生率正呈逐年提高的趋势，对于人类的生命健康产生了重要的威胁，目前根据心脏疾病的治疗方式，主要根据心血管疾病的防治机制以及相关治疗药物进行了大量深入的研究和探讨。在相关研究中以心肌细胞为主要实验对象，目的是为了进行心肌细胞培育，这也是相关研究的主要目的。通过体外培养心肌细胞，能够有效的维持心肌細胞原有的结构功能以及特点，也能够减少体液神经等因素对其的影响，因此通过体外培养心肌细胞是一项比较理想的实验方式。经过国内外相关学者的研究，进一步推进了心肌细胞培养技术的改良和更新，具体内容如下。

1 心肌细胞培养方法

在进行新的细胞培养工作的时候，主要包括两种细胞的培养，第一种为未成熟心肌细胞，也就是ECM，第二种是成熟心肌细胞，也就是ACM。未成熟心肌细胞具有部分增值能力，主要是通过电生理以及细胞膜离子通道等方面进行研究。而成熟心肌细胞主要为一种终末分化细胞，不具有增殖能力，所以在研究的时候，多采用单因素干预实验来进行研究[1]。在心肌细胞培养的过程当中，会受到其他很多因素的影响，其中主要包括化学试剂污染，操作过程污染以及培养环境污染等，所以培养实验的进行必须要保证在无菌条件下，而且要合适的对化学试剂进行选择，才能够保证心肌细胞有效培养。

1.1 未成熟心肌细胞培养

未成熟心肌细胞在培养的过程中主要分为四个阶段，第一个阶段为心肌细胞分离，在这个阶段过程中要通过组织块消化法或者酶消化法来对单个细胞进行分解，同时还要确保细胞能够存活下来，相关研究调查报告表示说明，培养法细胞存活率大于87%，通过酶消化法来培养细胞的细胞存活率为（94.70±2.31）%[2]。第二个阶段为心肌细胞收集，主要指的是对红细胞以及坏死心肌细胞或者未消化的组织块进行分离去除。第三个阶段为心肌细胞培养，也就是在不同的培养液中根据不同密度的细胞进行培养。

1.1.1 心肌细胞分离

主要采用的方式为Simpon 经典培养方法。首先积极研究对象的选择，所有研究对象均为消毒乳鼠，由相关人员在超净工作台中对乳鼠的胸壁进行打开，并且要将心脏迅速取出，将其装进具有冷缓冲液的培养皿中清洗，将多余的心房组织进行去除。相关的缓冲液主要包括即消毒乳鼠，在超净工作台上剪开胸壁，迅速夹取心脏，放入装有预冷缓冲液的培养皿中清洗，剪去心房组织。常用缓冲液有PBS液、Ringer氏液、KRB 液、D-Hanks液等[3]。其中运用PBS液对心室肌组织进行漂洗，主要原因是由于该缓冲液中具有青霉素和链霉素双抗，选择的时候要保证缓冲液中具有1%双抗。接下来再将红细胞以及凝血块清理干净，将其剪成1mm的块状，再通过组织块培养法或者酶消化法对组织进行分离。现如今，临床研究较为广泛的采用酶消化法来进行心肌细胞的培养，该种方法主要是将组织块内加入酶消化液，能够将其分散为单个细胞。而常用的消化酶主要有，透明质酸酶，胰蛋白酶以及胶原酶。其中胰蛋白酶的消化强度比较大，但是对心肌细胞的破坏程度也比较大。相比之下胶原酶的作用比较温和，对心肌细胞的损伤较小，可以通过水解细胞间胶原蛋白来达到分离组织的目的[4]。

1.1.2 心肌细胞收集

在进行心肌细胞收集的时候，可以将分离后的混合液进行静止，达到分层的目的，最后将上层的液体去除，反复操作，直到混合液达到半透明的状态。然后再将10～%20%的胎牛血清DMEM培养液注入到其中，并且达到终止消化的目的，同时再用不锈钢筛网将其过滤，将离心机调制到4℃、800～1000r/min，并将相关液体送至到离心机中进行离心工作，时间持续5～10分钟，结束之后将上层的液体清除，最后重悬心肌细胞。

1.1.3 心肌细胞纯化

收集工作完成之后要对心肌细胞进行纯化，主要是由于收集心肌细胞工作，并没有保证所有细胞都是心肌细胞，其中还含有其它细胞，主要包括成纤维细胞F。所以在进行心肌细胞纯化工作的时候，主要目的就是将F细胞进行去除。在进行心肌细胞纯化工作的时候，主要有不同种类的方式，其中主要包括离心法，差速贴壁分离法，调节温度法，无血清培养法以及化学试剂抑制法。其中离心法、调节温度法以及无血清培养法，对于心肌细胞的收缩以及生长功能产生了一定的影响，所以在目前研究中很少应用[5]。最常见的方法为化学试剂抑制法，主要是对F细胞的DNA以及蛋白质合成产生一定的抑制作用，同时起到心肌细胞纯化的效果。其中的化学试剂主要包括阿糖胞苷、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、谷氨酰氨，最常使用的试剂为5-溴脱氧尿嘧啶核苷。

1.1.4 心肌细胞培养

最后工作就是对心肌细胞进行培养，在此期间进行心肌细胞贴壁，但是该工作困难程度比较高，主要是依靠纤维蛋白、I型、IV型胶原以及层粘蛋白对相关物质进行贴壁。在工作之前要选择相关的排行榜和培养瓶，并选择一定的培养液，其中要保证培养液含有1%的双抗，首先要选择适当的培养液，对细胞悬液进行密度的调整，最后将调整好的细胞悬液置入培养液中，然后统一放置在37℃的培养箱中，在48小时之后进行培养液更换[6]。更换一次过后换为隔日更换培养液的频率。在对心肌细胞进行接种工作的时候，如果密度过大会影响心肌细胞贴壁情况，细胞容易出现营养不良。然而如果密度过小，就会导致细胞的间隙比较大，细胞之间各个组织之间的交流沟通比较困难，容易缩短持续收缩时间，细胞容易自动凋亡。一般情况下可以将接种密度保持在5×104～5×106/m L。

1.2 ACM

在培养成熟心肌细胞的时候，与未成熟心肌细胞相比，难度比较大，所以要对心肌细胞进行较好效果的急性分离，保证细胞培养环境无菌，具体培养过程与未成熟心肌细胞培养过程相似，在分离和培养过程中，具有较为明显的差别。

1.2.1 心肌细胞分离

首先要對重复心肌细胞进行分离所采用的方式主要包括三种，第一种为贴块培养法，第二种为心肌细胞浸泡法，第三种为离体心脏生物酶灌注法。在利用心肌细胞浸泡法的时候主要是通过浸泡来使生物酶对心肌细胞产生机制作用，但是时间不均，对心肌细胞组织块外表的破坏程度较大，所以很容易导致心肌细胞在培养过程中凋亡，所以，临床研究很少使用该种方式。另外贴块培养法所获取的细胞较少，也很少使用。相比之下只有离心心脏生物酶灌注法的应用比较广泛，多采用Langendorff灌注法[7]，虽然操作比较困难，但是分离较为彻底，值得进一步研究。

1.2.2 心肌细胞培养

根据相关学者对心肌细胞培养的定义，主要分为两种培养成熟心室肌细胞的方法，主要包括快速吸附法和去分化法。其中去分化法主要是对心肌细胞所保存于含血清的培养基中。但是细胞在培养基中会始终呈现着悬浮状态，从而导致原有的柱状形态逐渐变为球形形态。在细胞悬浮两天至4天之后，细胞开始向别的方向进行突起发展。在拓展的过程当中，细胞超微结构就表现出了去分化，但是这种方式培养出来的细胞在功能以及结构方面与其他细胞有差别，所以现如今已经很少使用。

2 结束语

总而言之，在体外进行心肌细胞的培养已经是目前相关细胞培养的重要方式，通过对心肌细胞的培养，能够有效的解决目前的心血管疾病，随着相关技术的日益成熟，该项研究也在逐渐发展中。

参考文献

[1]太原市罗塞塔石生物技术有限公司.一种心肌细胞和神经细胞专用培养皿：中国，CN201810917581.3[P].2018-12-14.

[2]同济大学.定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的培养基及方法：中国，CN201810497255.1[P].2018-09-14.

[3]重庆斯德姆生物技术有限公司.一种HCM心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法：中国，CN201711449694.7[P].2018-06-22.

[4]王佳南，林建安，杜苗苗.乳鼠心肌细胞原代培养方法的再改良[J].中外医疗，2018，37（33）：29-31.

[5]上海产业技术研究院，上海人类基因组研究中心.用于促进干细胞来源心肌细胞成熟的无血清培养体系：中国，CN201810154071.5[P].2018-08-28.

[6]东南大学.用于三维培养细胞和原位实时监测心肌组织的芯片装置及其应用：中国，CN201810224292.5[P].2018-08-07.

[7]中山大学附属第一医院.一种体外培养诱导的调节型巨噬细胞用于心肌保护的方法：中国，CN201810200942.2[P].2018-08-14.