液相色谱-质谱联用法测定血液中邻苯二甲酸酯

宋小飞，施召才，马伟文，银玉容，史 伟

液相色谱-质谱联用法测定血液中邻苯二甲酸酯

宋小飞，施召才，马伟文，银玉容，史 伟

（华南理工大学 环境与能源学院广东 广州 510006）

研究了加速溶剂萃取（ASE）/液相色谱-质谱联用技术测定血液中邻苯二甲酸单酯。血液样品经过冷冻干燥，利用加速溶剂萃取的方法，最后使用液相色谱-质谱仪分析检测PAEs成分。该方法的回收率为72.1%~136%；检出限为1.47~12.3 ng/L。通过对珠三角地区的成年男性采集的血液分析，发现除MBzP外，血液中其他m-PAEs的均有检出。血液中å8m-PAEs的质量浓度为（26.1±57.3 ng/g）。血液中以MBP、MiBP、MEHP和MnOP为主，分别占血液中m-PAEs浓度的36.7%、23.2%、15.1%和13.2%。

快速溶剂萃取；液相色谱-质谱；邻苯二甲酸酯

邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是一类内分泌干扰物，具有类雌激素作用和抗雄激素作用，可干扰机体内分泌系统，导致生殖发育系统异常，并且具有一定的肝脏毒性和致癌作用[1-3]。PAEs 可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入人体，并在体内发生代谢[4-6]。目前，PAEs人体内暴露评价普遍采用体内邻苯二甲酸酯代谢物作为生物标志物，对人体中邻苯二甲酸酯代谢物的研究将为PAEs的暴露评价提供重要信息[7]。

目前，环境中的PAEs含量分析方法比较多[8-19]，但是关于人体血液中的含量研究则相对较少。研究表明，PAEs作为环境内分泌干扰物，其对动物机体，尤其对于雄性个体具有生殖发育毒性和内分泌干扰作用，且具有致癌性和致突变性[20]。因此，建立一种简单、快速测定人血液中的痕量的PAEs 的分析方法具有很重要的意义。本研究采用样品冷冻干燥、ASE快速溶剂萃取的方式处理样品，使用液相色谱-质谱联用分析技术，检测血液样本中的8种邻苯二甲酸单酯（mono-PAEs或m-PAEs），以分析珠三角地区成年男性血液中PAEs暴露水平。

1 实验

1.1 仪器与试剂

仪器：1200-QQQ6410B液体相色谱/质谱联用仪（Agilent，美国）；ASE-150快速溶剂萃取仪（DIONEX，美国）；4KBTXL-75冷冻干燥机（VirTis，美国）；AD A10超纯水仪（Millipore，美国）。

试剂：m-PAEs标准品：MMP、MEP、MBP、MiBP、MBzP、MHP、MEHP、MnOP（Aldrich，美国）；回收率指示物：D4-MnBP（Aldrich，美国）；甲醇、醋酸、正己烷和丙酮（色谱纯，CNW，美国）；硅藻土（DIONEX， 美国）

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）；ODS Hypersil预处理柱（2.1 mm×10 mm，5 µm）；流速：0.5 mL/min。流动相：体积分数为0.01%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）。流动相梯度：0~5 min 50%A；5~6 min 50%~40%A；6~12 min 40%A；12~12.5 min 40%~15%A；12.5~20 min 15%A；20~20.5 min 15%~50%A；20.5~25 min 50%A。柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源电喷雾式离子源（electrospray ionization，ESI），负离子扫描模式；监测方式为多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源电压（喷雾电压）为–4000 V；干燥气为氮气，流速为9 mL/min，温度350 ℃；雾化器压力2.4´105Pa（35 Psi）；碰撞气为氮气。

1.3 样品前处理

（1）冷冻干燥。采集的血液样品保存于超低温冰箱（–80 ℃）中，取出后拿下盖子，用锡箔纸包好杯口，用针在锡箔纸上均匀扎孔；放入完成预冷的冷冻干燥机内进行冷冻干燥，干燥24 h，完成干燥后取出样品，冻干率11.12%；保存于超低温冰箱（–80 ℃），待分析。

（2）ASE萃取方法。准确称取生物样品于萃取池中，加入PAHs回收率指示物。ASE提取条件：第一步：温度100 ℃，压力1.034´107Pa（1 500 Psi），甲醇静态提取1个循环，循环持续5 min，以池体积60%的溶剂量冲洗提取池，氮气吹扫60 s；第二步：温度100 ℃，压力1.034´107Pa（1 500 Psi），正己烷-甲醇（体积比为1∶1）静态提取3个循环，循环持续5 min；以池体积60%的溶剂量冲洗提取池，氮气吹扫60 s；合并萃取液，洗脱液氮气吹干，甲醇定容至500mL，LC-MS分析。

1.4 质量控制与保证（QA/QC）

在优化条件下，分别测定不同浓度的m-PAEs混合标准溶液的峰面积，采用外标法定量。以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线。以信噪比为3 时的对应浓度作为方法的检出限（limit of detection，简称LOD），以信噪比为10 时的对应浓度作为方法的定量限（limit of quantification，简称 LOQ），根据低水平空白加标样品6 次平行分析结果的标准偏差计算获取m-PAEs 的方法相关系数，检出限和定量限。

取一定量生物样品，分别加入不同浓度的m-PAEs标准混合溶液以及相应量的回收率指示物，在确定的分析条件下，平行测定6次，计算m-PAEs及其m-PAEs回收率指示物的回收率与精密度。

2 结果与讨论

2.1 m-PAEs特征离子和定量离子和总离子流色谱图

m-PAEs对应的特征离子和定量离子见表1，m-PAEs标准溶液总离子流色谱图见图1。

表1 m-PAEs质谱分析条件

2.2 方法线性范围、相关系数、检出限和定量限

在确定的实验条件下，方法线性范围、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知，m-PAEs在0.01~250 ng/g范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9996~0.9999；方法检出限为1.47~12.3 ng/L，定量限为4.41~36.9 ng/L。

图1 m-PAEs总离子流色谱图

表2 m-PAEs方法的线性范围和检出限

2.3 方法回收率和精密度

加标回收率结果见表3。由表3可知，生物样品中的m-PAEs的回收率在72.1%~136%之间，相对标准偏差2.05%~4.53%。

表3 m-PAEs方法的回收率

2.4 实际样品分析检测

2.4.1 珠江三角洲地区人群血液中m-PAEs的暴露水平

珠江三角洲地区人群血液中8种m-PAEs的质量浓度见表4，血液中å8m-PAEs的质量浓度为1.87 ng/g~551 ng/g，中值为13.2 ng/g，平均质量浓度为（26.1±57.3）ng/g。血液中除邻苯二甲酸苄基酯（MBzP）外，MMP、MEP、MBP、MiBP、MHP、MEHP和MnOP都能被检出。

表4 血液中m-PAEs浓度 ng×g-1

注：ND表示未测出.

2.4.2 珠江三角洲地区人群血液中m-PAEs的组成特征

珠江三角洲地区人群血液中m-PAEs的组成特征如图2所示。由图2可知，血液中除MBzP未检出外，血液中MBP含量最高（36.7%）， MiBP次之（23.1%）， MEHP和MnOP的含量也较高。

图2 血液中8种m-PAEs含量比例

3 结论

珠江三角洲地区人群血液中å8m-PAEs的质量浓度为1.87 ng/g~551 ng/g，中值为13.2 ng/g，平均浓度为（26.1 ± 57.3） ng/g；血液中以MBP、MiBP、MEHP、MnOP为主要m-PAEs，在血液中的含量分别为36.7%、23.2%、15.1%、13.2%。血液中MBP含量>MiBP含量> MEHP含量>MnOP含量>MMP含量>MEP含量> MHP含量，MBzP未检出。

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Determination of phthalate esters in blood by liquid chromatography-mass spectrometry

SONG Xiaofei, SHI Zhaocai, MA Weiwen, YIN Yurong, SHI Wei

(School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The determination of monophthalate in blood by accelerated solvent extraction (ASE)/liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is studied. Blood samples are freeze-dried and extracted by accelerated solvent, and finally, PAEs are analyzed by the liquid chromatography-mass spectrometry. The recovery of this method is from 72.1% to 136%, and the detection limit is from 1.47 ng/L to 12.3 ng/L. Blood samples collected from adult males in the Pearl River Delta are analyzed, and it is found that all m-PAEs are detected except MBzP. The concentration ofå8m-PAEs in blood is (26.1+57.3 ng/g). MBP, MiBP, MEHP and ManOP are the main components in blood, accounting for 36.7%, 23.2%, 15.1% and 13.2% of m-PAEs concentration respectively.

accelerated solvent extraction; liquid chromatography-mass spectrometry; phthalate esters

R331.1；0657.63

A

1002-4956(2019)09-0053-04

2019-01-08

广东省自然科学基金项目（B6160760）

宋小飞（1980—）男，陕西西安，博士，高级实验师，主要从事环境监测和环境健康研究。

施召才（1982—）男，广东饶平，硕士，实验师，研究方向为环境监测和健康研究。

E-mail: zcshi@scut.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.014