血清趋化因子CCL5和CXCL10在刚地弓形虫急性感染早期诊断中的应用

李文东 唐 娟 卓 卫

福建省厦门市湖里区妇幼保健院 361009

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种寄生于有核细胞的原虫。呈全球性分布，在我国的阳性感染率为5%～10%[1]。弓形虫是一种条件致病病原体，宿主在感染后多呈现出隐性或亚临床症状。当宿主免疫功能受损时，可由于全身性播散性异常增殖和中枢神经系统受累而导致死亡。感染弓形虫是造成孕妇流产、早产、死胎、畸形的重要病因之一[2]。

刚地弓形虫可诱发宿主的细胞免疫应答，这对于抗弓形虫感染有着重要作用。感染初期，最先产生应答的是固有免疫反应[3]。宿主的单核巨噬细胞通过表面的Toll样受体识别弓形虫抗原，诱导某些细胞因子及趋化因子的分泌。此种反应产生于弓形虫速殖子感染阶段[4]。趋化因子的释放有助于急性或者复发性弓形虫病的炎症浸润，在宿主免疫早期促进中性粒细胞聚集于感染部位，进而参与弓形虫感染时的调控[5]，而趋化因子CCL5(C-C motif chemokine ligand 5)及CXCL10(C-X-C motif chemokine ligand 10)在弓形虫感染患者免疫中的作用仍不清楚，其是否可用于弓形虫感染联合诊断研究较少。因此了解CCL5及CXCL10对于早期诊断弓形虫感染、评估患者免疫能力有重要的临床意义。

本研究选取44例弓形虫感染患者的血清检测其趋化因子CCL5、CXCL10的异常表达，分析其联合检测在早期诊断弓形虫病的价值，并研究单个核细胞在弓形虫感染中免疫应答释放CCL5及CXCL10的水平。

1 对象和方法

1.1 研究对象 (1)44例弓形虫阳性血清取自2013年5月—2018年5月本院住院及门诊患者。其中IgM阳性30例，IgG阳性10例，IgM和IgG均阳性4例，均为经过进口弓形虫IgM和IgG检测试剂复查筛选结果一致的血清，男24例，女20例，年龄20～55岁。同时选取来自本院健康体检者待检阴性血清40份，男20例，女20例，年龄20～55岁。(2)单个核细胞抽提用全血来源为10例健康体检人群，5例IgG阳性患者。(3)实验所用虫株为刚地弓形虫RH株，由本实验室传代保种。

1.2 主要试剂与仪器 CCL5及CXC10的ELISA试剂盒购为美国R&D公司。细胞用培养基为美国Hyclone,胎牛血清、双抗为美国Gibco。淋巴细胞分离液Ficoll为Solarbio。酶标仪为美国BioTek酶标仪。

1.3 方法 (1)人单个核细胞(PBMC)的提取。将5ml新鲜抗凝血与5ml无菌生理盐水充分混匀，沿管壁缓慢叠加于10ml淋巴细胞分离液Ficoll，水平离心1 500rpm,15min。离心后离心管内分为3层，用移液管吸取悬于中间的白色浑浊层置于另一离心管中，加入10ml PRMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素， 100U/ml链霉素)，洗涤细胞2次。弃去上清，加入10ml 5% 小牛血清PRMI-1640完全培养基培养。(2)弓形虫感染单个核细胞模型的建立。计数2×106单个核细胞/孔于RPMI-1640完全培养基，于37℃、5%CO2孵箱培养。单个核细胞分为2组，a组为培养基培养单个核细胞24h作为阴性对照，b组为单个核细胞与刚地弓形虫速殖子10∶1共培养24h。取培养液上清待测。(3)趋化因子CLL5与CXCL10的检测。采用美国R&D ELISA试剂盒检测血清及细胞培养上清中的CLL5及CXCL10含量。根据说明书要求准备试剂，并将血清进行50倍稀释，细胞液进行10倍稀释，分别配置标准品。加样后室温孵育2h,弃去液体，洗涤液洗3遍后加入CLL5/CXCL10抗体，室温孵育2h后洗3遍，加入底物后室温避光孵育30min，加入终止液，使用美国BioTek酶标仪在450nm波长下进行比色，记录结果，进行统计。

2 结果

2.1 刚地弓形虫感染患者及健康对照组血清中CCL5与CXCL10的水平比较 刚地弓形虫感染患者的血清CCL5、CXCL10水平明显高于健康对照组。IgM单阳性患者为急性感染期，其血清CCL5、CXCL10水平较健康人水平高(t=9.168,t=7.699,P<0.01),且较IgG单阳性患者，即既往感染患者血清CCL5、CXCL10水平高(t=3.518,P<0.01；t=2.392,P<0.05)，各组间结果差异均有统计学意义。见表1、图1。

表1 刚地弓形虫感染组及健康对照组血清CCL5和CXCL10水平的比较

注：与健康对照组比较，*P<0.01；与IgG阳性组比较，#P<0.05。

图1 刚地弓形虫感染组及健康对照组血清中CCL5和CXCL10的水平测定

2.2 刚地弓形虫感染患者血清CCL5和CXCL10水平相关性分析 刚地弓形虫感染患者(IgM阳性、IgG阳性、IgM和IgG双阳性)血清中CCL5和CXCL10含量呈明显正相关(r=0.46，P<0.01)，见图2。

图2 刚地弓形虫感染患者血清CCL5和CXCL10水平相关性分析

2.3 刚地弓形虫速殖子和人单个核细胞共培养培养基趋化因子水平的检测 为比较人PBMC在早期感染刚地弓形虫与既往感染PBMC再次感染弓形虫时分泌趋化因子CCL5与CXCL10的水平，该实验将正常人PBMC与IgG阳性患者PBMC分别与RH株刚地弓形虫速殖子共培养，检测其细胞上清CCL5及CXCL10水平。与速殖子共培养后，正常PBMC及患者PBMC分泌CCL5和CXCL10含量较阴性对照组均升高，差异有统计学意义(t=6.138,t=3.070,P<0.01)。正常PBMC分泌CCL5和CXCL10较患者PBMC高，但差异无统计学意义，见表2，图3。

表2 PBMC与RH株弓形虫速殖子共培养细胞上清CCL5和CXCL10水平的比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.01。

图3 PBMC与RH株弓形虫速殖子共培养细胞上清CCL5和CXCL10水平测定

2.4 血清CCL5和CXCL10检测联合诊断刚地弓形虫早期感染的价值 通过绘制ROC曲线发现，血清CCL5和CXCL10联合诊断弓形虫早期感染曲线下面积为0.872，95%可信区间为0.822～0.962，标准误为0.036，P<0.01，敏感度为0.88，特异度为0.864，约登指数为0.744，见图4。

图4 血清CCL5和CXCL10联合诊断弓形虫感染的ROC曲线

3 讨论

弓形虫是一种可入侵有核细胞的机会致病原虫。免疫功能正常的人群感染弓形虫后，临床过程具有自限性，少见明显的症状。然而对于结核病、肿瘤或器官移植等免疫功能受损或低下的患者，弓形虫的感染则可引起严重的临床症状[6]。此外，孕妇感染弓形虫后，可通过胎盘导致畸胎、早产或死胎等严重并发症，因此孕前或妊娠期弓形虫感染的早诊断、早治疗，具有相当重要的优生优育意义[7]。目前临床常用检测弓形虫IgG和IgM来对弓形虫感染进行诊断，但该检测方法具有一定的局限性，如患者处于感染灰区时间，且若患者免疫力低下等均会造成检测的假阴性，用于该法检测的单克隆抗体多为小鼠抗体，若样本内存在抗小鼠抗体等嗜异性抗体会造成结果的假阳性，故临床急需利用多项目联合检测以提高弓形虫病的早期诊断率及敏感性。本研究则通过对弓形虫患者的血清趋化因子CCL5及CXCL10分析，发现弓形虫病患者血清CCL5、CXCL10水平明显高于正常人，且在早期感染患者血中呈高水平分布，与感染阶段密切相关， 此发现说明CCL5、CXCL10联合诊断在弓形虫早期感染诊断中的价值。同时，本研究采用体外实验方法共培养PBMC和RH弓形虫速殖子，检测单个核细胞在急性弓形虫感染和复发感染情况下CCL5及CXCL10的水平，发现首次感染初期PBMC分泌CCL5及CXCL10水平明显高于已感染过弓形虫患者的PBMC分泌水平，进一步奠定了血液、体液中CCL5、CXCL10含量用于检测弓形虫早期感染的诊断价值。

趋化因子是一类在炎症反应中可诱导白细胞募集和激活的多肽蛋白，相对分子质量8～10kD[5]。根据其分子结构中N-末端半胱氨酸残基的相对位置可分为CXC(α)、CC(β)、C(γ)、CX3C(δ)四个亚家族，至今已发现超过60种。趋化因子是通过结合细胞膜表面不同类型的趋化因子受体而发挥作用的，一方面趋化因子定向募集白细胞在感染局部发挥抗感染作用，另一方面其诱导的局部炎症反应易造成局部的组织损伤[8]，故趋化因子有助于控制弓形虫的感染。不同类型的趋化因子可选择性作用于免疫细胞，引起定向迁移。趋化因子CCL5[9]是CC趋化因子家族成员之一，主要定向趋化和激活T淋巴细胞和NK细胞。通过与其相应受体结合发挥多种不同的生物学功能，调节免疫炎症进程。在抗感染免疫中起重要作用。炎症反应中多种细胞可分泌CCL5，引起CCL5表达水平的升高[10]。CXCL10又名IFN-γ诱导蛋白10(IFN-γ-inducible protein10，IP-10)[11-12]，主要通过与趋化因子受体3结合，发挥炎症趋化作用。作为T细胞特异性活化趋化诱导剂，促进细胞毒性T细胞募集，发挥抗弓形虫作用，从而影响弓形虫感染的进程。对CXCL10的检测同时可了解弓形虫感染的进展。Akitoshi等人[13]发现在野生型小鼠感染眼弓形虫病后， CCL5和CXCL10表达均升高。Gopal等人[14]在发现肠上皮细胞感染刚地弓形虫后，CCL5和CXCL10的水平也会升高。但目前国内外文献多采用动物模型进行研究，本研究采用对患者血清CCL5和CXCL10水平检测，讨论其在临床诊断中的应用价值，并探讨弓形虫感染PBMC，亦影响CCL5和CXCL10水平。

综上所述，血清趋化因子CCL5及CXCL10的调控在弓形虫早期感染中发挥重要作用，其血清含量的检测作为一种方便、经济的生物标志物可作为弓形虫早期感染的辅助诊断标志物，与弓形虫抗体联合诊断有助于弓形虫病的早诊断早治疗。