氮浓度、温度和照度对波吉卵囊藻繁殖模式的影响

杨敏志，李长玲，黄翔鹄，王清珍，陈爱珊

氮浓度、温度和照度对波吉卵囊藻繁殖模式的影响

杨敏志1,2,3，李长玲1,2,3，黄翔鹄1,2,3，王清珍2,3，陈爱珊2,3

（1. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518000；2. 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；3. 广东省藻类养殖及应用工程技术研究中心，广东 湛江 524025）

【】探索波吉卵囊藻（）的繁殖模式，调控其生殖过程以实现藻生物质稳定增长。在荧光显微镜下观察波吉卵囊藻似亲孢子形成过程，探究温度、照度、氮浓度对其繁殖模式的影响。波吉卵囊藻以2、4和8似亲孢子型模式繁殖，在藻细胞第二轮分裂过程中因分裂不同步，有时也形成3个似亲孢子。氮限制和弱光显著影响波吉卵囊藻繁殖模式（< 0.05）。通常情况下，波吉卵囊藻以4似亲孢子型繁殖模式繁殖，但在缺氮和弱光下2和3似亲孢子型模式的频率上升。在15 ~ 35 ℃温度范围内，波吉卵囊藻繁殖模式变化不大。波吉卵囊藻有4种繁殖模式。在不良环境中，2和3似亲孢子型模式频率上升。

波吉卵囊藻；似亲孢子；繁殖模式

藻类繁殖规律是藻类学研究的重要内容，也是藻类培养的理论基础。约在60 a前，Tamiya等首次实现小球藻（sp.）的同步化培养[1]，并用于细胞周期的生化和生理分析。同时，Howard和Pelc第一次将细胞周期划分为G1、S、G2和M四个阶段[2]。此后，相继建立了栅藻（sp.）和衣藻（sp.）等绿藻的典型细胞周期模型[3-6]。与多数其他真核生物不同，绿藻通常在一个细胞周期中进行多轮细胞物质复制，多重分裂后，母细胞通常形成2个子细胞（是从1到10的整数），子细胞数量受环境条件影响[7,8]。波吉卵囊藻（）是一种绿藻，无性生殖，通常由2、4和8个细胞形成细胞群，群体外有一层明显胶质包被[9]，因而种群稳定、适应能力强。定向培育可辅助波吉卵囊藻抢占养殖水体生态位，有效降低水体氨氮、亚硝态氮等有害物质浓度，广泛用于养殖水域生态调控[10-12]。但在波吉卵囊藻生物学研究方面进展缓慢，Snow[13]发现，波吉卵囊藻细胞通过二分裂和多重分裂形成2、4或8个似亲孢子，子代细胞包裹在母细胞残留的细胞壁中。本研究利用波吉卵囊藻这一特性，以群体中细胞数量代表细胞繁殖模式，探究氮浓度、温度、光照对其细胞繁殖模式的影响，描述其繁殖规律，并补充波吉卵囊藻孢子形成过程，为波吉卵囊藻的池塘定向培育提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 藻种

实验用波吉卵囊藻由广东海洋大学水产学院藻类资源开发与养殖环境生态修复实验室提供。

1.2 培养条件

波吉卵囊藻接种于无菌改良培养基[14,15]。波吉卵囊藻置于恒温光照培养箱中以设定基本培养条件培养，培养温度为（25 ± 1）℃，光暗比12D∶12L，照度2 500 lx，pH值7.9 ~ 8.0，为确保海水中不含任何营养盐，实验用海水均为基于 Harrison经典配方配制的人工海水，盐度控制在28 ± 1。

1.3 波吉卵囊藻的细胞繁殖模式

在波吉卵囊藻培养至暗周期后，定时取1 mL藻液，用体积分数2.5%戊二醛处理4 h，离心收集藻细胞，用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，用终质量浓度20 μg/mL的SYBR Green I（497 nm，520 nm）或DAPI（340 nm，488 nm）避光染色20 min，装片，于Nikon倒置荧光显微镜Ti-E上观察波吉卵囊藻藻体形态和细胞分裂时叶绿体（440 nm，680 nm）、细胞核变化，并拍照。

1.4 不同培养条件下各细胞繁殖模式的频率分布

基于基础培养条件进行不同条件对细胞繁殖模式影响的单因素实验。氮浓度梯度设计为0、0.25、0.5、1、2 mmol/L；照度梯度设计为0、1 000、2 000、3 000、4 000 lx；温度梯度设计为15、20、25、30、35 ℃。初始接种浓度为每毫升5 × 104个藻细胞，每个处理设置3个重复实验。培养期间每天定时摇瓶3 ~ 4次。波吉卵囊藻培养至光周期6 h后细胞分裂基本完成，子细胞包裹在母细胞胶化膨大的细胞壁中，形成孢子囊状结构。每24 h采集5 mL藻悬液，持续168 h。采集的样本制片后，于显微镜下计数，以孢子囊中细胞数目作为判断细胞繁殖模式的依据。每个样品计数100个孢子囊，最后取3个重复的平均值。

1.5 数据分析

使用Excel统计、作图，统计软件SPSS 19.0分析各模式的频率与环境因子的相关性，利用Adobe illustrator CC 2018绘制细胞繁殖模式示意图。

2 实验结果

2.1 波吉卵囊藻的细胞繁殖模式

一般情况下，波吉卵囊藻多以二分裂的方式繁殖，通常是同步且连续的两轮分裂，形成4个似亲孢子（图1，图2：c1-c3）；少数只分裂1次，形成2个似亲孢子（图1，图2：a1-a3）；或在第2轮分裂过程中，部分原生质团脱离分裂进程，最终形成3个似亲孢子（图1，图2：b1-b3）。极少数的波吉卵囊藻在分裂前期先经过多轮的细胞核分裂后形成多核巨细胞，近球形，体积远大于其他细胞繁殖模式下的母细胞，随后原生质分裂，在细胞核周围产生分裂沟（cleavage furrow），细胞分裂结束后形成8个似亲孢子（图1，图2：d1-d3）。

图1 波吉卵囊藻细胞繁殖模式

Fig. 1 Diagrammatic representation of different types of reproduction patterns found in O. borgei

a-d: 波吉卵囊藻的4种细胞繁殖模式； a1-a3: 2似亲孢子型；b1-b3: 3似亲孢子型； c1-c3: 4似亲孢子型；d1-d3: 8似亲孢子型；a2-d2: 与a1-d1对应的荧光图片，黄绿色为 SYBR Green I，蓝色为DAPI，红色为叶绿素自发荧光。 a-d: four types of reproduction pattern found in O. borgei; a1-a3: two-autospore type; b1-b3: three-autospore type; c1-c3: four autospore type; d1-d3: eight-autospore type; a2-d2, the fluorescence images corresponding to a1-d1, SYBR Green I in yellow-green, DAPI in blue and chlorophyll spontaneous fluorescence in red 图2 波吉卵囊藻的细胞繁殖模式观察 Fig. 2 The types of the reproduction pattern found in O. borgei

2.2 氮浓度对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响

不同氮浓度条件下，波吉卵囊藻细胞繁殖模式的频率分布如图3所示。在不同氮浓度下波吉卵囊藻均以4似亲孢子型的细胞繁殖模式为主，占40 %以上。在氮素消耗殆尽后，波吉卵囊藻无法维持4似亲孢子型的繁殖模式，2和3似亲孢子型的频率上升，4似亲孢子型频率下降。1 mmol/L和2 mmol/L组出现极少数8似亲孢子型，频率在1% ~ 2%之间。

图3 不同氮浓度条件下各细胞繁殖模式所占比例随培养时间的变化 Fig. 3 Frequency of cell reproductive patterns under different nitrogen concentration culture conditions changed with culture time

2.3 照度对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响

图4表明，波吉卵囊藻的细胞繁殖模式以4似亲孢子型为主。在黑暗环境下，4似亲孢子型的频率随时间增加而下降，2似亲孢子的频率随时间增加而上升，在1 000 ~ 4 000 lx的照度下，4似亲孢子型的频率随强度增加而升高。

图4 不同照度条件下细胞繁殖模式所占比例随培养时间的变化 Fig. 4 Frequency of cell reproductive patterns under different light intensity culture conditions changed with the culture time

2.4 温度对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响

温度对波吉卵囊藻繁殖模式的影响如图5所示，5个温度处理下，波吉卵囊藻均以4似亲孢子型的繁殖模式为主，且频率随时间的增加而增加，但在15 ℃时，4似亲孢子型的频率增长速率显著低于其他组（P < 0.05）。

图5 不同温度条件下各细胞繁殖模式所占比例随培养时间的变化 Fig. 5 Frequency of cell reproductive patterns under different temperature culture conditions changed with the culture time

3 讨论

3.1 波吉卵囊藻的细胞繁殖模式

绿球藻目藻类的主要繁殖方式是孢子繁殖，即通过产生似亲孢子的方式进行无性生殖，亲代细胞在二分裂或多重分裂后，产生2n（n为整数）个子细胞。Borowitzka等[16]根据二分裂和多重分裂将微藻划分为两种周期类型，又以细胞核分裂发生的顺序，分为连续型（consecutive pattern）和聚合型（clustered pattern）（以栅藻和衣藻为代表）。波吉卵囊藻在2似亲孢子型和4似亲孢子型的形成过程中，细胞核分裂发生在细胞分裂后期，属于聚合型的细胞周期，与衣藻类似。而8似亲孢子型则先通过细胞核连续3轮分裂后，形成多核母细胞，随后在细胞核附近产生分裂沟，形成8个子细胞，这与栅藻相似，属于连续型的细胞周期。除2、4和8似亲孢子型的繁殖模式外，波吉卵囊藻的3似亲孢子型繁殖模式是第1次被描述，这一现象普通小球藻(Chlorella vugaris)[17,18]同样存在，可能是由于母细胞在第2轮分裂形成4似亲孢子的过程中，其中一个原生质团脱离了分裂进程，最终形成3个似亲孢子。

选取本院收治的患者88例作为研究对象，将其分为两组，各44例。其中，护理组男20例、女24例，年龄26～90岁，平均（52.28±4.19）岁，疾病类型：颅脑外伤16例、脑积水10例、脑脓肿14例、其他4例；对照组男21例、女23例，年龄21～88岁，平均（52.40±3.97）岁，疾病类型：颅脑外伤15例、脑积水11例、脑脓肿13例、其他5例。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 氮浓度对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响

氮是限制微藻细胞生长最重要的营养因子，是影响细胞生长和代谢的重要因素。Olson等[19]研究表明，在缺氮条件下，卡特前沟藻（Amphidinium carteri）的细胞周期滞留在G1期。Vaulot[20]在研究威氏海链藻（Thalassiosira weissflogi）和卡氏膜球藻（Hymenomonas carterae）时也得出相同结论。波吉卵囊藻在缺氮环境中，4似亲孢子型的频率下降，2似亲孢子型和3似亲孢子型的频率上升，可能是由于氮供给不足，导致细胞物质合成量不足，细胞无法达到获得更多的承诺点(commitment point)，一个细胞周期内只完成一次二分裂，或者“不完全”的多重分裂，繁殖模式与卡特前沟藻等真核藻类的氮限制响应是一致的。

3.3 照度对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响

绿藻是一类光能自养型生物，光是其重要能量来源，对细胞周期起重要调节作用。早在20世纪60年代，已有大量文献报道照度对小球藻、链带藻（Desmodesmus sp）、栅藻和衣藻同步化培养的影响[21-26]。如Zachleder[27]在卵配衣藻（Chlamydomonas eugametos）的同步培养中发现，随着照度的增加，细胞周期的持续时间明显缩短，细胞分裂次数也从2次增加至4次。Vítová[28]也报道了莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）子细胞数量从最低照度的2个子细胞增加到最高照度的16个。波吉卵囊藻在黑暗环境中4似亲孢子型的频率下降，2似亲孢子型的频率上升，表明波吉卵囊藻在光限制的情况下，细胞物质合成受阻；波吉卵囊藻在1 000 lx的照度下，4似亲孢子型的频率开始平缓上升，也表明波吉卵囊藻细胞物质的合成在弱光条件下即可完成。

首先，全面收集区域概况资料、土壤污染源资料、土壤环境和农产品资料及其对应的图件资料等，并通过分析，研究有关信息划分区域内的地理单元，为污染风险评价提供基础支撑；其次，通过评估土壤及农产品调查点位的土壤重金属污染情况、农产品重金属污染情况，反映该点位土壤和农产品重金属污染状况，划分点位土壤重金属风险等级，为区域风险评价提供基础依据；最后，通过评价单元内土壤重金属污染风险、农产品重金属危害风险、重金属生物可利用性等因素的情况，反映区域内耕地土壤和农产品重金属污染情况，划分区域内土壤重金属风险等级，为重金属污染耕地分级管理提供依据。

3.4 温度对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响

温度的变化影响细胞的整个新陈代谢。Morimura[29]利用椭球小球藻（Chlorella ellipsoidea）完成了描述温度影响细胞周期同步化的第一份报告。他观察到两个有趣的现象：不同温度下的生长速度不同，细胞分裂持续的时间也不同；然而，在所有的温度条件下，细胞均分裂成4个子细胞。这一现象在其他藻类中得到了反复验证：温度影响藻细胞的生长速度，细胞周期随着温度的升高而缩短[27,30]。波吉卵囊藻在10 ~ 32 ℃均可正常生长繁殖，最佳的培养温度在25 ~ 30 ℃[31]。从本研究可见，20 ~ 35 ℃对波吉卵囊藻细胞繁殖模式的影响不大，说明波吉卵囊藻有很好的温度适应性。15 ℃时4似亲孢子的频率及上升幅度低于其他组，暗示着15 ℃时细胞周期持续时间比其他组长，这与Morimura等[29]的结果相符。

4 结论

波吉卵囊藻存在2似亲孢子型、3似亲孢子型、4似亲孢子型和8似亲孢子型4种细胞繁殖模式。在氮限制和缺乏光照时，主要以产生2或3个似亲孢子的方式扩大种群。

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Influences of Nitrogen Concentration, Light Intensity and Temperature on the Cell Reproductive Pattern of Oocystis borgei

YANG Min-zhi1,2,3, LI Chang-ling1,2,3, HUANG xiang-hu1,2,3, WANG Qing-zhen2,3, CHEN Ai-shan2,3

（1. Shenzhen Research Institute, Guangdong Ocean University, Shenzhen 518000, China; 2. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 3. Guangdong Research Center for Algae Culture and Applied Engineering, Zhanjiang 524025, China）

Abstract:【Objective】To explore the cell reproductive pattern of Oocystis borgei, regulate its reproductive process, and realize a stable growth of O. borgei. 【Method】Under the fluorescence microscope, the reproductive process of O. borgei was observed, and the effects of temperature, light intensity and nitrogen concentration on its reproductive pattern were investigated. 【Results】Four types of reproductive pattern were found in O. borgei, namely the two, four, eight autospore types and three sporozoites. Three autospore types occasionally formed through asynchronous splitting in the second round of cell division. Nitrogen limitation and weak light significantly affectedthe cells reproductive pattern of O. borgei (P < 0.05). In general, O. borgei proliferates through popularity, forming four daughter cells with the frequencies of two and three autospore types that increased under conditions of nitrogen deficiency and at low light intensity. Temperature affected the reproductive pattern of O. borgei insignificantly.【Conclusion】There were 4 types of reproductive pattern in O. borgei, and the frequencies of two and three autospore types increased in the environment different from the favorite. The type frequencies of the cell reproductive pattern of O. borgei may aid in estimating its growth performance.

Key words：Oocystis borgei; autospore; reproduction pattern

中图分类号：S968.41+9

文献标志码：A

文章编号：1673-9159（2019）05-0044-06

doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.007

收稿日期：2019-02-25

基金项目：活性微藻制品产业化关键技术的研究与示范（KY20180112）；广东海洋大学博士启动项目

第一作者：杨敏志（1992―），男，硕士研究生，研究方向为水产养殖。E-mail: 2693140787@ qq.com

通信作者：李长玲, 女, 教授, 研究方向为水域生态学。E-mail:ybc1901@126.com

杨敏志，李长玲，黄翔鹄，等. 氮浓度、温度和照度对波吉卵囊藻繁殖模式的影响[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（5）：44-49.

（责任编辑：刘庆颖）