不同烤烟品种(系)二萜类物质合成关键基因的表达及代谢差异

张思琦，何 佳，周 方，徐世晓，陈 芳，张安乾，刘 超，杨铁钊

(河南农业大学 烟草学院，河南 郑州450002)

烟草二萜类物质是指由4个异戊二烯单元相连而组成的碳原子骨架[1]，其为次生代谢物，是烟叶重要的香气前体物质。烟草二萜类物质由烟叶表面腺毛合成并分泌，是腺毛分泌物的主要成分，在一定程度上影响卷烟的香气质量和烟气特征，与烟株抗性也有关[2-5]。烟草二萜类物质主要分为单环西柏烷类和双环赖百当类两大类。其中单环西柏烷类化合物主要包括西柏三烯一醇和西柏三烯二醇，经调制和陈化后降解为茄酮及其衍生物。茄酮作为烤烟中含量最丰富的中性香味物质之一，本身具有很好的香气，可改善烟草香味[6]。双环赖百当类化合物主要包括顺-冷杉醇和赖百当烯二醇，经过调制和醇化后降解为降龙涎香内酯、降龙涎香醚、脱氢降龙涎香内酯等，这些香气物质赋予烟气一种柏木样的香气和香味，能够提高卷烟香吃味[7]。

烟草二萜类物质生物合成途径分为西柏烷类合成途径和赖百当类合成途径2类。在西柏烷类合成途径中，香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)通过空间上的折叠形成西柏烷类碳骨架结构，在西柏三烯醇环化酶(CBTS)催化作用下环化形成α-和β-西柏三烯一醇[8]；在细胞色素P450羟化酶(CYP450)氧化作用下，西柏三烯一醇合成α-和β-西柏三烯二醇[9]。在赖百当类合成途径中，GGPP以另一种方式折叠形成赖百当类碳骨架结构，在柯巴基焦磷酸合酶(CPS2)催化作用下形成8-羟基-柯巴基焦磷酸(8-OH-CPP)；在顺-冷杉醇合成酶(ABS)和香紫苏醇合成酶(SCLS)催化作用下，8-OH-CPP分别合成顺-冷杉醇和赖百当烯二醇。

前期研究已明确,由DXR基因编码5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)催化5-磷酸脱氧木酮糖(DXP)生成甲基赤藓醇-4-磷酸(MEP)，以决定二萜类物质合成前体GGPP生成量[10]。CYC-1基因编码西柏三烯醇环化酶(CBTS)参与西柏三烯一醇合成[11]。CYP71D16基因编码细胞色素P450羟化酶(CYP450)参与西柏三烯二醇合成[12]。CPS2基因编码柯巴基焦磷酸合酶(CPS2)参与8-羟基-柯巴基焦磷酸合成，ABS基因编码的顺-冷杉醇合成酶(ABS)参与顺-冷杉醇合成[13]。目前，前人研究多集中在二萜类物质代谢的合成和积累上，针对不同烤烟品种二萜类物质分子调控机制的研究较少。为探究不同烤烟品种(系)二萜类物质代谢特点，解析不同烤烟品种(系)二萜类物质差异原因及相关分子调控机制，本研究通过q-PCR技术对二萜类物质合成关键基因DXR、CYC-1、CYP71D16、CPS2、ABS进行检测，应用GC-MS技术对二萜类物质及调制后二萜降解产物含量进行测定，并结合感官质量评价，通过相关分析进一步探索二萜类物质及降解产物与烤烟感官质量评价各指标间相互关系，为高香气烟草品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料有8306、豫烟11、豫烟12、K326、红花大金元、云烟87共计6个烤烟品种(系)。其中，8306、豫烟11为河南农业大学自选高香气烤烟品种(系)；豫烟12为自选优质多抗烤烟；K326、红花大金元、云烟87为全国大面积推广种植良种。

2017年3月1日播种，5月1日移栽于河南省郑州市河南农业大学科教园。试验土壤是壤质潮土，各环节管理参考当地优质烟叶生产技术标准。选取大田生长发育一致的烟株，以中部叶作为研究目标。当烟草中部叶叶长为1.5 cm时开始计算叶龄，于叶龄60 d时，每个品种(系)挑选5株长势一致的烟株，每株取其同一叶位中部叶2片，沿主脉两侧截取4片直径为10 cm的叶圆片，每个品种(系)共计20片，用于叶面分泌物的提取，重复3次。同时各品种(系)取同一叶位长约10 cm中部叶，一部分用于RNA提取，一部分用于测序，重复3次。待烟叶落黄成熟后，各品种(系)在同一烘烤条件下烘烤，按照GB 2635-1992对烤烟进行分级，取烤后烟叶(C3F)3 kg平均分成两份，一份经过烘干粉碎过孔径0.250 mm筛，装入自封袋中保存，用于烤烟萜类成分测定；另一份经去梗、切丝，卷制成单料烟，平衡烟支水分后，用于烟叶感官质量评价。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草叶片总RNA的提取 RNA抽提：采用CTAB法提取参试材料叶片的总RNA。将提取的RNA加入适量DEPC水溶解，于-80 ℃保存。反转录：样品采用随机引物法反转录合成cDNA。配制Mix Ⅰ、Mix Ⅱ反应体系，所得到的cDNA于-20 ℃保存。q-PCR扩增：根据GenBank发布的DXR、CYC-1、CYP71D16、CPS2、ABS和Actin(作为内参基因)序列设计各基因扩增引物(表1)。荧光定量PCR反应体系为20 μL：2.0 μL 10×PCR Buffer，1 μL Mg2+，0.5 μL dNTPs，0.3 μL SYBR(20×)，正反引物各0.5 μL，0.2 μLTaqDNA Polymerase，1 μL Template，14 μL ddH2O。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。依据Ct值，计算相对表达量并作图。

表1 荧光定量引物序列Table 1 Sequences of fluorescence quantitative primers

1.2.2CPS2基因序列比对测定 利用CTAB法抽提DNA，设计CPS2引物序列K48-dF：5′-ATCATAGCGGAATTGTTTGTCTC-3′；K48-dR：5′-TCCGTATAGATACCTAAGCGATCTG-3′，对阳性植株进行PCR检测。PCR扩增体系：1 μL DNA样品，10×PCR buffer 2 μL，dNTP mixture 0.4 μL，正反引物各0.2 μL，rTaqDNA polymerase 0.2 μL，ddH2O加至20 μL。扩增条件：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min，30个循环。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。利用DNAMAN 3.0软件进行CPS2基因的序列比对。

1.2.3 叶面分泌物二萜类物质的测定 参照陈伟等[14]的方法，将各烟草品种(系)叶圆片置于500 mL二氯甲烷中浸提，每片每次浸提2 s，反复浸提4次。收集剩余的二氯甲烷加入1 mL含正-17-烷醇的内标以及10 g无水硫酸钠，过滤后在旋转蒸发仪中浓缩至50 mL，经氮吹仪吹干、衍生化反应后，进入GC-MS进行检测分析。通过NIST12检索谱库确定各类物质成分，并使用内标法对物质定量。

1.2.4 烤后烟叶萜类降解产物测定 同时蒸馏萃取装置一端接入500 mL圆底烧瓶，向内加入10.000 g烤后烟样、1.0 g柠檬酸、500 μL含硝基苯的内标和350 mL蒸馏水，恒温电热套加热；另一端接入250 mL圆底烧瓶，向内加入40 mL二氯甲烷，恒温水浴锅加热。同时蒸馏萃取2.5 h后收集250 mL圆底烧瓶中的液体，加入10 g无水硫酸钠并过滤，在水浴锅中水浴浓缩至1 mL左右，采用 GC-MS进行检测分析。通过NIST12检索谱库确定各类物质成分，并使用内标法对物质定量。

1.2.5 感官质量评价 烤烟感官质量的评价由河南中烟工业有限责任公司技术中心的评吸人员组织进行。评吸指标包括香气质、香气量、浓度、柔细度、余味、杂气、刺激性、劲头、燃烧性、灰色，各指标最大标度为9分，各项指标得分之和即为总分，共计90分。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 20.0统计软件对试验数据进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行显著性检验和相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同烤烟品种(系)二萜类物质合成关键基因的表达差异

由图1可知，不同烤烟品种(系)各基因的相对表达量存在差异。DXR是脱氧木酮糖磷酸代谢途径中二萜类化合物合成的上游关键基因。DXR在不同烤烟品种(系)中均有表达，其中以8306相对表达量最高，其次为豫烟11、K326、豫烟12、红花大金元和云烟87，相对表达量较低。CYC-1和CYP71D16共同控制西柏烷类化合物的合成。CYC-1和CYP71D16在不同烤烟品种(系)中均有表达，其中以8306表达量最高，其次为豫烟11、K326、云烟87，豫烟12和红花大金元的相对表达量较低。CPS2和ABS共同控制赖百当类化合物的合成。CPS2在8306和豫烟11中高表达，但在其余4个烤烟品种中表达量都很低。ABS在各品种(系)中均有表达，以K326表达量最高，其次为红花大金元、云烟87，而豫烟12、8306和豫烟11表达量较低。

1.8306；2.豫烟11；3.K326；4.豫烟12；5.红花大金元；6.云烟87。图柱上标不同小写字母表示P<0.01水平差异显著。图3同1.8306；2.Yuyan 11；3.K326；4.Yuyan 12；5.Honghuadajinyuan；6.Yunyan 87.Different lowercase letters in same column indicate significant difference at P<0.01 level. The same for Fig.3图1 不同烤烟品种(系)二萜类物质合成关键基因的表达情况Fig.1 Expression analysis of key genes of diterpenoid biosynthesis in different flue-cured tobacco varieties (lines)

2.2 不同烤烟品种(系)CPS2基因序列差异

CPS2基因cDNA序列包含一个2 409 bp的开放阅读框。测序结果(图2)表明，不同烟草品种(系)CPS2基因序列存在差异，表现在CPS2基因第二外显子第456位碱基上。8306、豫烟11碱基表现为G，而红花大金元、K326、云烟87、豫烟12碱基表现为T(与NCBI数据库中该基因序列完全一致),即红花大金元、K326、云烟87、豫烟12在第456位碱基上产生一个SNP突变，由G转变为T，该变化导致在突变处产生一个终止密码子。

1.8306；2.豫烟11；3.K326；4.豫烟12；5.红花大金元；6.云烟87 1.8306；2.Yuyan 11；3.K326；4.Yuyan 12；5.Honghuadajinyuan；6.Yunyan 87

2.3 不同烤烟品种(系)叶面分泌物二萜类物质的差异

烟草叶面分泌物中的二萜类物质主要包括单环西柏烷类和双环赖百当类。不同烤烟品种(系)叶面分泌物二萜类物质差异比较见图3。由图3可知，不同烤烟品种(系)叶面分泌物中西柏三烯二醇含量显著高于西柏三烯一醇，其中8306的西柏三烯一醇含量最高，其次为豫烟11、K326、云烟87，豫烟12和红花大金元较低；西柏三烯二醇含量也表现出此规律。赖百当类物质主要包括顺-冷杉醇和赖百当烯二醇，仅在豫烟11、8306中检测到，在其余烤烟品种中均未检测到。根据CPS2基因测序结果证明，碱基基因型为T品种(红花大金元、K326、云烟87、豫烟12)不含顺-冷杉醇，而碱基基因型为G的品种(系)(8306、豫烟11)含有顺-冷杉醇，基因型与表型相对应。

2.4 不同烤烟品种(系)烤后烟叶二萜类降解产物差异分析

由表2可知，不同烤烟品种(系)西柏烷类降解产物含量存在显著差异，表现为8306>豫烟11>K326>红花大金元>云烟87>豫烟12。各烤烟品种(系)均未检测到赖百当类降解产物。新植二烯含量表现为8306>豫烟11>K326>豫烟12>云烟87>红花大金元。

2.5 不同烤烟品种(系)感官质量评价

由表3可知，各烤烟品种(系)感官质量总分从高到低的顺序为豫烟11>8306>K326>云烟87>豫烟12>红花大金元。豫烟11较其他品种(系)表现为香气质和柔细度稍好、浓度稍浓、刺激性稍小、灰色较白。8306较其他品种(系)表现为香气量和余味稍好、杂气尚轻、刺激性稍小。K326较其他品种(系)表现为劲头较大，燃烧性稍好。

图3 不同烤烟品种(系)叶面分泌物二萜类物质差异比较Fig.3 Comparison of diterpenoids in secretion of different flue-cured tobacco varieties (lines)

烤烟品种Flue-cured tobacco varieties含量/(μg·cm-2) Content西柏烷类降解产物 Cembranoid degradation products新植二烯Neophytadiene总量Total830652.95±1.65 aA1 028.12±4.57 aA1 081.07豫烟11 Yuyan 1144.77±1.23 bB970.00±5.33 aA1 014.77K32641.67±1.11 cB948.69±4.94 bA990.36豫烟12 Yuyan 1222.98±2.65 eD846.81±3.41 cB869.79红花大金元 Honghuadajinyuan30.80±1.24 dC576.64±4.57 eD607.44云烟87 Yunyan 8730.70±1.53 dC727.15±3.86 dC757.85

注：同列数据后标不同小写字母和大写字母分别表示在P<0.05和P<0.01水平差异显著。

Note：Different small letters and capital letters indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01 levels,respectively.

表3 不同烤烟品种(系)烟叶感官质量评分Table 3 Sensory quality score of different flue-cured tobacco varieties (lines)

2.6 烤烟二萜类物质及其降解产物与感官质量评价的相关性

由表4可以看出，二萜类物质总量与香气量、柔细度、杂气、刺激性和感官质量评价总分均呈极显著正相关(0.953**，0.922**，0.953**，0.981**和0.959**)，与香气质、灰色均呈显著正相关(0.909*和0.873*)。二萜类降解产物总量与香气质呈极显著正相关(0.938**)，与杂气、刺激性和感官质量评价总分均呈显著正相关(0.864*，0.907*和0.873*)。

表4 烤烟二萜类物质及其降解产物与感官质量评价的相关性Table 4 Correlation between diterpenoids,degradation products and sensory quality evaluation of flue-cured tobacco

注：*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上显著相关。

Note:* and ** indicate significant correlation atP<0.05 andP<0.01 levels,respectively.

3 讨 论

3.1 不同烤烟品种(系)二萜类物质及其降解产物

研究认为薄荷[15]、香椿[16]、烟草[17]等作物腺毛的二萜类物质与香气密切相关。烟草西柏三烯二醇的主要降解产物茄酮，可作为衡量烟叶香气物质量的重要指标。茄酮的转化产物如茄醇、茄酸、降茄二酮、茄尼呋喃及其酯等物质都是重要的致香物质[7]。本研究中，不同烤烟品种(系)二萜类物质及其降解产物存在明显差异，这可能与烟草品种特色密切相关，如8306和豫烟11具有较高西柏三烯二醇，顺-冷杉醇和赖百当烯二醇仅在8306、豫烟11中检测到，调制后8306和豫烟11西柏烷类降解产物含量显著高于其他品种，但并未检测到赖百当类降解产物，这可能是由于鲜烟叶中顺-冷杉醇含量过低，在调制后期被逐渐分解或降解后含量过低难以检测到。大多数研究认为，顺-冷杉醇多存在于一些香料烟和部分雪茄烟中，而烤烟、白肋烟、马里兰烟中一般不存在[18]。王冬等[19]利用GC-MS对不同烤烟品种(系)腺毛分泌物组分检测未发现赖百当类化合物存在。而Sallaud等[13]、王国平[20]则在部分烤烟品种中检测出顺-冷杉醇。本研究亦在8306和豫烟11中检测到赖百当类化合物。前人研究结果不一致的原因可能是烟草种质资源具有多样性，顺-冷杉醇亦存在于部分烤烟品种中。烟叶感官质量是其内在品质的综合反映。相关性分析结果表明，二萜类物质总量与香气质、香气量、柔细度、杂气、刺激性、灰色和感官质量评价总分呈极显著或显著相关关系，二萜类降解产物总量与香气质、杂气、刺激性和感官质量评价总分呈极显著或显著相关关系。由此认为二萜类物质及其降解产物能够改善烟叶香气质，增加烟叶香气量，减少杂气及降低刺激性，从而起到增添香气，柔和烟气的作用，明显提升卷烟品质。

3.2 不同烤烟品种(系)二萜类物质合成关键基因的表达

本研究结果表明，8306和豫烟11中DXR、CYC-1、CYP71D16基因相对表达量显著高于其他品种，同时其西柏三烯一醇、西柏三烯二醇含量均显著高于表达量低的品种。相关研究表明DXR的上调表达能促进IPP生成较多GGPP底物[10]；CYC-1的上调表达促使GGPP向西柏三烯一醇转化[21-22]；同时CYP71D16的高表达促进了西柏三烯一醇发生羟化反应形成西柏三烯二醇[12]。由此推测，8306和豫烟11西柏烷类化合物含量较高主要是由于DXR和CYC-1、CYP71D16的上调表达，这与王冬等[19]的研究结果一致。

Sallaud等[13]对157份烟草品种进行NtABS和NtCPS2差异研究发现，无论产生顺-冷杉醇与否，各品种中NtABS基因cDNA序列没有差异，而不产生顺-冷杉醇的品种中CPS2基因cDNA序列部分碱基发生突变存在两种多态性，一是出现一个8碱基插入序列，二是出现一个SNP突变，即由G转变为T，这两种多态性均造成其编码肽链的提前终止，编码蛋白丢失相应活性位点，丧失了其原有蛋白功能。本研究结果表明，CPS2基因仅在产生顺-冷杉醇品种(系)(8306、豫烟11)中高表达，而ABS基因在不产生顺-冷杉醇的品种(K326、红花大金元、云烟87、豫烟12)中高表达。对不同烟草品种(系)CPS2基因测序结果表明，不同品种(系)CPS2基因存在差异，在产生顺-冷杉醇的品种(系)(8306、豫烟11)中，CPS2基因第二外显子第456位碱基表现为G，在不产生顺-冷杉醇的品种(系)(K326、红花大金元、云烟87、豫烟12)中，该处碱基产生一个SNP突变，由G转变为T,该变化导致在突变处产生一个终止密码子，造成其编码肽链的提前终止。该结果验证了部分品种不产生顺-冷杉醇与CPS2表达受阻有关，这与Sallaud等[13]、王国平[20]的观点相一致。

4 结 论

不同烤烟品种(系)二萜类物质及其降解产物、基因表达量存在明显差异，这与品种特色密切相关。DXR和CYC-1、CYP71D16的上调表达是8306和豫烟11西柏烷类化合物含量较高的主要原因。CPS2碱基突变导致表达受阻可能是部分品种不产生顺-冷杉醇的原因。二萜类物质及降解产物总量与感官质量评价各指标间相关性分析表明，二萜类物质及其降解产物能够起到增添香气、柔和烟气的作用。在生产过程中可作为育种手段应用在高香气品种的选育中，从而增加烟叶二萜类物质含量，改善烟叶内在品质，提高烟叶香气质量。