山东省枣种质资源遗传多样性分析

孟晓烨，韩传明，公庆党*，王翠香，孙超

(1.山东省经济林管理站，山东济南 250014；2.山东省林业科学研究院)

枣(ZiziphusjujubaMill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(ZiziphusMill.)植物，原产中国，栽培历史悠久，种质资源丰富，据《中国果树志·枣卷》统计全国有枣树品种700余个。山东省是枣的主要栽培区，全省枣栽培面积8.73万hm2(130.9万亩)，产量75.1万t，收集保存枣品种资源370份[1]。枣树适应性强，抗旱、耐涝、耐瘠薄、耐盐碱，在丘陵山区、盐碱地、沙滩地均可栽植，是绿化荒山、沙荒地的先锋树种，也是主栽区林农的主要经济来源，兼具生态效益、社会效益和经济效益。

随着经济发展，交通便利，枣种质资源的交流愈来愈频繁，常出现来源混淆、同名异物、同物异名等现象，对种质资源进行品种鉴定和亲缘关系研究对提高枣种质资源利用效率，促进有序开发具有重要作用。RAPD(随机扩增多态性DNA标记)、SSR(简单重复序列标记)、iSSR(简单重复序列间)、AFLP(扩增片段长度多态性)等分子标记技术从DNA水平揭示了品种间的不同与联系，相比传统的形态学、孢粉学、细胞学和同工酶等具有更快速、准确、高效的特点。其中AFLP分子标记技术兼具RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)技术的可靠性和RAPD技术的方便性，具有多态性条带丰富、重复性好、灵敏度高等优点，被广泛应用于枣种质资源鉴定和研究[2,3]。笔者利用AFLP分子标记技术对山东省乐陵市现有的30个枣品种进行了品种鉴定及遗传多样性分析，以期为山东省枣种质资源研究提供理论依据，为资源利用和品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的30个枣品种均来自山东省乐陵市，采集正常生长树的幼嫩叶片进行试验(表1)。

1.2 试验方法

DNA提取。采用CTAB改良法提取样品DNA[4,5]。称取叶片材料约0.05g，液氮研磨3～4次；将磨碎的粉末放到装有800μl 2×CTAB提取缓冲液的2ml离心管中；加入60μl巯基乙醇混匀，60℃预热30分钟，其间混匀2～3次，取出样品于室温放置；冷却后加入800μl的氯仿与异戊醇(24∶1)混合液，振荡混匀，12000rpm离心15分钟；取上清液到一

新的2ml离心管中，加入1.5倍体积的1×CTAB沉淀液，放置20～30分钟，12000rpm离心15分钟；将沉淀晾干，溶于200μl TE-buffer；加入400μl 95%乙醇，20μl 3M NaAC，-20℃沉淀1小时；4℃离心，12000rpm离心15分钟；500μl 75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心10分钟；加入30～50μl TE-buffer溶解沉淀；0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

限制性酶切及连接反应。反应体系(20μl)：DNA模板(50ng/μl)4μl，Adapter1μl，EcoRI/MseI 2μl，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl，ddH2O 7μl。混匀离心数秒，37℃保温5小时 ，8℃保温4小时，4℃过夜。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切连接产物。

预扩增。反应体系(25μl)：DNA模板 2μl，Pre-ampmix(预扩增引物，序列见表2)1μl；dNTPs1μl；10×PCR buffer 2.5μl；Taq 酶0.5μl；ddH2O18μl。PCR扩增参数：94℃变性2分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸80秒，30个循环；72℃延伸 5分钟；4℃贮藏。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩产物。

表1 试验材料

表2 预扩增引物序列

选择性扩增。预扩产物1∶20稀释后作为选扩模板。反应体系(25μl)：预扩稀释样品2μl；10× PCR buffer 2.5μl；dNTP 0.5μl；EcoRI 引物1μl(共8种)；MseI 引物1μl(共8种)；Taq酶0.5μl；ddH2O 17.5μl 。PCR扩增参数：94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 80秒，1个循环；每轮循环退火温度递减0.7℃，12个循环；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 80秒，23个循环；4℃贮藏。4%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产物。

1.3 数据统计与分析

通过GENESCAN软件进行数据统计，根据Marker片段范围为70～500bp，设置读取范围为69.5～501.5，读取条带。在原始数据的基础上，有记作“1”，无记为“0”，构成01矩阵。通过NTSYS软件计算样本间的遗传距离，NJ法进行聚类分析，构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 筛选出的引物组合及扩增条带多态性比较

从64对引物组合中，筛选出条带清晰、多态性好的引物组合8对，共扩增出1178条清晰条带，其中多态性条带1148条，多态性比率97.45%。说明30个枣树品种在DNA水平存在较大的差异，具有较高的遗传多样性。筛选出的8对引物组合中扩增总条带数最多180条，最少117条(图1)，多态性比率最高100%，最低95.10%(表3)。说明筛选出的8对引物组合针对性强、效率高，有利于对供试枣树品种进行遗传多样性分析。

表3 8对引物组合及扩增条带的多态性

图1 引物组合AAC/CTT 对30个枣树品种的扩增条带

2.2 枣品种间遗传距离

30个品种间的遗传距离在0.2935～0.7794，平均遗传距离为0.5663。马牙枣和麻皮枣遗传距离最大，为0.7794，亲缘关系最远；傲雪和沾冬2号遗传距离最小，为0.2935，亲缘关系最近。以傲雪、乐金4号、沾冬2号3个新品种为例进行分析。

傲雪是2015年由山东省林业科学研究院选育的特晚熟制干新品种，平均单果重5.63g，在山东省德州地区11月中旬成熟[6]。与其他29个枣品种遗传距离为0.2935～0.6942，平均遗传距离为0.6106，存在较大的遗传差异，是一个新品种。与尖枣遗传距离最大，为0.6942，亲缘关系最远；与沾冬2号遗传距离最小，为0.2935，亲缘关系最近；与冬枣遗传距离为0.4883。

乐金4号是由山东省林业科学研究院选育的抗裂果枣新品种，平均单果重5.95g。与其他29个枣品种遗传距离为0.5347～0.6694，平均遗传距离为0.5816，存在较大的遗传差异，是一个新品种。与东关枣遗传距离最大，为0.6694，亲缘关系最远；与圆铃枣遗传距离最小，为0.5347，亲缘关系最近，与无核2号、普通金丝小枣遗传距离分别为0.5394、0.5411。该结果与选育时认为乐金4号由金丝小枣选育而来的结论矛盾。

沾冬2号是由沾化县选育的晚熟鲜食新品种，平均单果重21.9g，在山东省沾化10月上中旬成熟(比沾化冬枣晚7天)[9]。与其他29个枣品种遗传距离为0.2935～0.6734，平均遗传距离为0.5942，存在较大的遗传差异，是一个新品种。与茶壶枣遗传距离最大，为0.6734，亲缘关系最远；与傲雪遗传距离最小，为0.2935，亲缘关系最近；与冬枣遗传距离0.4708。

2.3 枣品种聚类分析

如图2，将30个枣品种聚类可分成4个大类(Ⅰ-Ⅳ)，第Ⅱ类又分为4个亚类(1-4)。

图2 30个枣品种的AFLP聚类图

Ⅰ类中包括冬枣、傲雪、沾冬2号、早丰脆、胎里红5个品种，其中冬枣、傲雪、沾冬2号又聚为一个小类。

Ⅱ类中的第1亚类包括金丝新4号、马牙枣2个品种；第2亚类包括美蜜、长酸枣、鲁枣2号、伏蜜脆、脆酸枣、仲秋红6个品种，其中鲁枣2号、伏蜜脆、脆酸枣都为早熟品种；第3亚类包括长红枣、尖枣、早大红、辣椒枣4个品种，为来源不明的早大红品种的起源及分类提供了科学依据；第4亚类包括芒果枣、灰枣、鲁枣1号、马棱枣、无核2号、无核3号、普通金丝小枣、麻皮枣、东关枣9个品种，认为这些品种的选育跟金丝小枣有关，该结果与鲁枣1号是由金丝小枣自然实生选育出的极早熟鲜食品种[10]、 无核3号是无核金丝小枣优良无性系品种[11]研究结论一致，也为来源不明的马棱枣东关枣品种的起源及分类提供了科学依据。

Ⅲ类包括磨盘枣、圆铃枣2个品种。

Ⅳ类包括茶壶枣、乐金4号2个品种。

Ⅲ类和Ⅳ类两个聚类层间的距离很小，4个品种都具有抗裂果的优良性状[8,12]。

3 小结与讨论

利用AFLP标记方法对30个枣品种进行了遗传多样性分析，供试的30个枣品种间遗传差异较大，具有丰富的遗传多样性。通过品种间遗传距离和聚类图分析，鉴定了近年来选育的傲雪、乐金4号、沾冬2号与原有品种不同。从基因水平对30个枣品种进行系统分类，科学的解决了枣品种选育过程中起源不明或品种混淆的问题，该研究结果为下一步开展枣早熟、晚熟、抗裂果等性状研究提供基础。