液相色谱质谱法测定萤火虫荧光素

李东芹

摘要[目的]建立快速测定D-虫荧光素的液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）分析方法，并对荧光素的碎裂机理进行解析。[方法]采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱，甲醇、水梯度洗脱12  min进行色谱分离;在质谱正离子模式下，用6对反应监测离子对（MRM）进行定性、定量分析。[结果]目标化合物在0.625～125.000 μg/L线性关系良好（r=0.996 9），检出限为0.250 μg/L（S/N为5）。[结论]该方法灵敏度高、选择性好，不仅可用于萤火虫发光机理、发光强弱差异、发光颜色差异方面的研究，还可以用于其他需要定量测定荧光素的研究。

关键词 液相色谱-串联质谱;快速分析;D-荧光素钾盐;萤火虫;荧光素

中图分类号 S-03文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）15-0191-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.052

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract[Objective]A rapid high performance liquid chromatographymass spectrometry（HPLCMS/MS）method was developed for the determination of DLuciferin.The DLuciferin fragmentation mechanism was analyzed.[Method]The HPLC separation was carried on the shimpack VPODS column（150 L×2.0 mm，5 μm） with methanol and water eluting gradiently in 12  min.The DLuciferin was detected by using 6 multiple reaction monitoring （MRM） in ESI positive mode of mass spectrometer.[Result]There was a good linear relationship within the range of 0.625-125.000 μg/L（r=0.996 9）.The quantitative determination limit was 0.250 μg/L（S/N=5）.[Conclusion]The method is sensitive and selective. It can be used to detect DLuciferin rapidly in the firefly or other research .

Key words HPLCMS/MS;Rapid analysis;DLuciferin;Firefly;Luciferin

作者简介 李东芹（1978—），女，安徽泗县人，实验师，硕士，从事大型仪器分析与实验技术研究。

收稿日期 2019-03-06

萤火虫属鞘翅目萤科，是萤科昆虫的通称，因其尾部能发出萤光，故名为萤火虫。萤火虫的发光是其体内荧光素在荧光素酶催化下发生氧化反应所释放的能量形成的。不同品种、不同性别和不同生长时期的萤火虫，其发光部位、发光强弱、发光颜色又有很大的差异[1-2]。现有对萤火虫发光机制的研究一般集中在荧光素酶的活性、稳定性、立体结构影响发光颜色等方面[3-7]，而对萤火虫荧光素的研究非常少。除了少量萤火虫荧光素人工合成[8-10]方法报道外，关于萤火虫荧光素的定量测定方法鲜见报道。已报道的荧光素类物质，如荧光素钠、荧光黄、荧光桃红等的测定方法有荧光分光光度计法[11]、拉曼光谱法[12]和高效液相色谱法[13-14]等，这些分析方法理论上也可以用于萤火虫荧光素的测定，但是灵敏度和选择性相对较差。笔者利用液相色谱质谱高灵敏和高选择性的特点，建立萤火虫荧光素的定性、定量分析方法。

1 材料与方法

1.1  试材 4000Qtrap 串联三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex公司）; LC-20AD高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）;Milli-pore 超纯水仪（美国Millipore公司）; 蠕动泵（Hamilton 公司）;离心机（贝克曼公司）。甲醇（色譜纯，默克公司）;超纯水; 乙酸（色谱纯）;1 mL医用注射器;022 μm微孔滤头（上海安普）;D-虫荧光素钾盐（上海前生生物有限公司）;穹宇萤样品（华中农业大学付新华老师提供）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备。

精确称取萤火虫尾部组织，液氮研磨后加1 mL 95 ℃热水匀浆萃取15 min，离心取上清500 μL，加500 μL正己烷，混匀后静置分层，取下层水溶液经0.22 μm微孔滤头过滤后上机分析。

1.2.2 仪器条件。

1.2.2.1 色谱条件。岛津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱，样品室温度为室温;流动相：A为01%的乙酸水溶液，B为含2 mmol/L醋酸铵的甲醇溶液;流速为0.25 mL/min ，柱温箱温度为室温，进样量为5 μL。梯度洗脱条件为：B∶A，0 min 为15∶85（V/V），5 min 为 100∶0（V/V），8 min 为100∶0（V/V），8.1 min为15∶85（V/V），12 min程序结束。

1.2.2.2 质谱条件。采用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下选用多反应离子监测（MRM）扫描模式进行定量分析。电喷雾电压5 500 V;离子源温度：500 ℃;离子源辅助气GS1/GS2气流均为50 L/h。质量扫描范围m/z 50～300，二级质谱碰撞能量：31eV。

2 結果与分析

2.1 质谱参数优化

用蠕动泵直接进样，对500 μg/L的荧光素钾盐标准品溶液进行母离子全扫描，在阳离子模式下得到荧光素钾盐的[（M-nK）+（n+1）H]型母离子为281.1;优化电压、离子源温度和辅助气等参数使分子离子峰最强;在以上质谱条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，得到荧光素钾盐的二级质谱碎片离子（图1）;继续对解簇电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口电压（CXP）等质谱参数进行优化，在DP为90 V、EP为10 V、CE为31 V、CXP为10 V条件下，荧光素的母离子、子离子信号强度比例适中;选取丰度最大的子离子235.2与母离子组成MRM定量离子对（281.10→235.2，选177.2、194.2、876、105.3、203.0 子离子与母离子组成5个辅助定性离子对。

2.2 荧光素的质谱裂解方式

根据图1荧光素在正离子模式下的离子碎片信息，推测可能存在以下3种主要的碎裂方式（图2）。荧光素钾盐的准分子离子峰[（M-nK）+（n+1）H]为m/z 281.1，脱去一个羧基后得到m/z 235.2的碎片离子;2位的碳氮键和4位的碳硫键同时断裂，重排后可得到m/z为177.1 和105.3的碎片离子;1，3共轭双键之间发生重排反应后，4位的碳正离子不稳定，碳氮键和5位的碳硫键继续断裂，重排后可得到m/z为87.2和194.1的离子碎片，这一步碎裂方式与文献[15]结果一致。

2.3 萤火虫样品中荧光素的定性检测

选取荧光素6个主要子离子碎片，组成6对MRM特征离子对，同时监测这6个反应，即m/z 281.1→235.2、194.2、177.2、105.3、87.2、203.0。若样品中目标化合物在每级反应监测过程中出峰并且保留时间相同，便可以确认其存在。6对特征离子对几乎全部盖了D-虫荧光素的所有碎裂途径，定性结果准确可靠。图3为D-虫荧光素钾盐标准品和雌萤火虫中6对特征离子对的检测结果，试验结果证实萤火虫所含的荧光素结构为D-虫荧光素。

2.4 方法的灵敏度和特异性

将荧光素钾盐稀释成1 mg/mL的母液，用超纯水逐步稀释成浓度为125.0、62.5、31.3、12.5、6.25 μg/L系列梯度的标准溶液。在“1.2.2”仪器条件下进行上机分析。在MRM模式下选择信号最灵敏的m/z 281.1→235.2为定量离子对，以标准溶液的浓度为横坐标x、相应的荧光素峰面积为纵坐标y，得到标准曲线方程为y=3 630x+4 870（r=0.996 9），表明目标化合物在0.625～125.000 μg/L线性关系良好。在当前试验条件下，方法的定量限为0.625 μg/L（S/N=10），检出限为0.250 μg/L（S/N=5）。

只用单一离子对扫描检测目标成分时，有时会同时出现几个色谱峰，如图3中m/z 281.1→87.2 和m/z 281.1→105.3 这2个离子对，在标样和样品中均出现几个峰，此时就很难确定目标成分峰。当检测指标增加至6个离子对时，目标成分就非常好辨认。在每个MRM离子对谱图（图3）中，同一保留时间均出现的色谱峰只有一个，即是目标成分。

2.5 实际样品检测

分别精确称取穹宇萤的雌、雄、幼尾部组织，按照“1.2.1”方法处理后，在“1.2.2”仪器条件下上机测试，由外标标准曲线定量得到每100 g雌虫、雄虫和幼虫的荧光素含量分别为362.69、725.00、13.76 μg。

3 结论

该研究建立的萤火虫荧光素液相色谱-串联质谱测定方法，有效避免了液相色谱法、分光光度法中基质的干扰，具有快速、灵敏、选择性高等特点。该方法不仅可以用于萤火虫发光机理、发光强弱、发光颜色差异等方面的研究，也可用于虫荧光素人工合成及其他研究中荧光素的定量分析。

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