天麻素穴注对癫痫模型大鼠行为学、脑电及线粒体损伤程度的影响*

肖 飞,于婷婷

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

癫痫是一种中枢神经功能失常性疾病，多由局部或全脑神经元异常放电所导致。本病发作时常常伴随着短暂的感觉、运动、意识及自主神经功能异常，且脑电图往往伴有癫痫波的发放。大量报道证实[1]，作为传统名贵中药天麻主要的药物活性成分，天麻素(对羟基苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)具有抗癫痫的作用，但其具体抗癫痫机制目前尚未能明确。本研究拟通过PTZ点燃大鼠癫痫模型，注射天麻素溶液于百会及大椎穴，观察经治疗后癫痫大鼠行为学、脑电变化及电镜下CA3区线粒体半定量评分，以进一步说明天麻素穴注抗癫痫、改善认知及脑保护的作用机理，为临床治疗提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级健康雄性Wistar大鼠120只，体质量250～325 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。于SPF级动物实验室常规适应性喂养1周后，将大鼠标记编号，按随机数字表法分为空白组、模型组、穴注组及西药组，每组30只。

1.2 实验药物、试剂及配置方法

天麻素(规格为0.2 g/支，昆明制药集团股份有限公司生产,批号：H20013046)于150 mL 0.9%氯化钠溶液中充分溶解，溶液浓度为2 mg/mL，成人用量为0.088 6 mL/kg，换算成等效剂量0.37 mL/kg；丙戊酸钠片(规格为0.2 g/片，山东仁和堂药业有限公司生产,批号：H19983059)充分溶解于羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂公司生产)，配成混悬灌胃液，质量浓度为20 mg/mL，4℃遮光保存。PTZ：购自美国Sigma公司(Sigma-P6500)，于每次实验前30 min，取300 mg PTZ晶体，放入150 mL 0.9%氯化钠溶液中充分溶解，配置PTZ溶液的质量浓度为2 mg/mL。10%水合氯醛溶液：购自天津市大茂化学试剂厂。

1.3 造模方法

每日上午8：30—11：30进行给药，予PTZ溶液35 mg/kg，造模周期为28天。每次注射后，观察1 h大鼠的行为变化，而后进行痫性发作评价，根据Racine分级标准[2]对大鼠的痫性发作情况进行评价，并记录每只大鼠的痫性发作等级，对可能发生的意外情况进行干预，如出现3 min及以上的V级发作时，立即以10%水合氯醛腹腔注射以终止其痫性发作，防止死亡。造模周期内，连续5天出现Ⅳ级及以上的痫性发作，视为造模成功。

1.4 各组处置方法

空白组在造模周期内予腹腔注射0.9%氯化钠溶液1 mL，连续28天；模型组按上述造模方法给予处置；穴注组在造模成功后，参照《实验针灸学》[3]及华兴邦制定的《实验动物图谱》[4]提供的方法，定位大鼠百会及大椎穴，做好标记，以0.37 mL/kg天麻素溶液分别进行穴位注射，隔日1次，连续28天;西药组在造模成功后，连续28天给予丙戊酸钠溶液(350 mg/kg)灌胃，日1次。

1.5 取材

水迷宫实验结束后，腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg以对大鼠进行麻醉，起效后，固定大鼠，开胸，灌注，断头，迅速分离海马及脑组织，将1 mm3大小组织块置于2.5%戊二醛固定液中前固定，4℃保存2 h以上，用于制作大鼠海马CA3区线粒体透射电镜标本。

1.6 观察指标及检测方法

造模成功率：造模成功后，在开始治疗之前记录各组大鼠死亡数量及原因，计算造模成功率。

脑电图变化：末次治疗结束后，每组随机选出10只大鼠进行视频脑电监测。用10%的水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，起效后将大鼠固定于脑立体定位仪上暴露颅骨，根据Paxinos&Waston脑图谱[5]，于大鼠背侧海马区安装直径小于1 mm的双极性钢电极1个，在颅骨上安装不锈钢皮质电极3个，植入2个电极于额皮质内，左右各1，参考电极放于小脑，并以牙托粉及牙科水泥固定[6]。待大鼠完全清醒后记录各组脑电图1 h，记录各组脑电图形，并分析其癫痫自发性发作的频率与脑电波幅。(参与脑电记录的大鼠不再参与水迷宫实验。)

水迷宫实验：末次治疗结束后，每组在剩余大鼠内再随机选出10只大鼠进行Morris水迷宫实验。先将大鼠逐一放入水池，任其自由游泳以熟悉水迷宫内环境，时长为2 min；治疗结束后第1～2天为定位航向训练，在任一象限将大鼠头朝池壁放入水中，记录其找到水下平台的时间，若下水120 s以后还未找到平台，则人为引导并停留10 s在平台上，训练连续两天，上午下午各1次，记录最后1天大鼠寻找并爬上平台所需的时间(潜伏期)；第3天为空间探索试验，撤除平台后，从同一入水点将大鼠放入水池，计时120 s，记录各组Wistar大鼠穿越原平台的次数。

电镜下线粒体半定量分级：制作大鼠海马CA3区线粒体透射电镜标本，将标本置于 JEM-1200型投射电子显微镜下拍照，并参照Kloner[7]线粒体半定量分级记分方法，每个电镜标本随机选择10个视野，再从每个视野中随机选择10个线粒体，观察计算每级所占百分比。Kloner分级标准：0级：超微结构正常；1级：线粒体肿胀，可见嵴的分隔、基质密度降低；2级：线粒体肿胀较1级更明显；3级：线粒体肿胀并伴有结构破坏；4级：3级的表现伴有线粒体内外膜崩解。

1.7 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，所有数据以均数±标准差表示，进行单因素方差分析及显著性检验。若方差齐时采用LSD法检验，方差不齐时进行转换后再重复以上分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模成功率

除去空白组30只大鼠，本次实验共对90只大鼠进行腹腔注射PTZ造模，在造模过程中，模型组因癫痫持续状态时间过长、程度过重、抢救不及时死亡3只；穴注组因腹腔注射后感染死亡1只，3只因未达到点燃标准而弃用；西药组3只未达到点燃标准故弃用；实验共计点燃80只，点燃成功率为88%。

2.2 脑电图检测结果

各组脑电图如图1，空白组大鼠脑电图表现为正常波形，癫痫组脑电表现出阵发性痫性放电，治疗后穴注组与西药组癫痫波较模型组明显减少。模型组与空白组数据有明显差异(P<0.01)，模型组脑电波幅显著升高(P<0.01)；与模型组比较，穴注组及西药组脑电波幅显著降低(P<0.01)，癫痫发作频率明显减少；穴注组与西药组比较无差异(P>0.05)。见表1。

注：脑电电极从上到下依次为左额叶、右额叶、左海马、右海马。图1 各组脑电图

表1 各组脑电图检测结果比较

注：与空白组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与西药组比较，3)P>0.05。

2.3 Morris水迷宫实验结果

模型组与空白组数据有明显差异(P<0.01)，模型组大鼠潜伏期明显延长，空间探索试验中模型组的穿越平台数明显少于空白组；与模型组比较，穴注组及西药组潜伏期时间及穿越平台数均有显著差异(P<0.01)，潜伏期时间均较模型组明显缩短，穿越平台数均明显增多；穴注组与西药组比较无差异(P>0.05)。见表2。

表2 Morris水迷宫实验各组大鼠平均潜伏期与穿越平台次数的比较

注：与空白组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与穴注组比较，3)P>0.05。

2.4 电镜下海马线粒体超微结构损伤程度

电镜下各组海马区线粒体超微结构如图2所示，空白组海马神经元的线粒体超微结构无损伤，而模型组、穴注组及西药组的线粒体则均有不同程度的损伤。海马CA3区线粒体半定量损伤评分结果显示，与模型组比较，穴注组及西药组均有显著差异(P<0.05)，且损伤程度均较模型组有所减轻。而穴注组与西药组比较则无差异(P>0.05)。见表3。

图2 电镜下各组海马区线粒体超微结构

组别n损伤程度评分(%)0级1级2级3级4级空白组301000000模型组27001.72±0.191.95±0.3196.33±0.56 穴注组2600049.88±1.0850.12±0.52∗西药组270026.34±0.5949.68±0.3123.98±0.29∗

注：与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

癫痫为大脑功能失调性疾病，以大脑局部病灶突发性的异常高频放电并向周围组织扩散为特征，本病发病机制复杂，涉及到神经元电生理活动的各个环节。作为原发性癫痫的理想模型，PTZ可较好地模拟人类癫痫自发、反复及长期发作的特点[8]。

中医用天麻来治疗癫痫历史悠久，《本草纲目》记载天麻“主风湿痹，四肢拘挛，小儿风痫惊气”。现代药理研究也表明，天麻具有镇静安眠、中枢抑制、抗炎、清除自由基、抗凋亡、调节神经递质、抗氧化应激等作用。在研究天麻素对PTZ致痫大鼠的脑保护作用中，穆朝娟等[9]发现，天麻素能减轻模型大鼠由癫痫导致的脑损伤，包括血管内皮细胞、星形胶质细胞和海马区神经元的损伤。

中医学经络理论认为，癫痫主要病机为督脉经气阻滞、气血逆乱，而督脉被认为是人体诸阳经的总汇，有“总督诸阳”之功，为“阳脉之海”,对整个经络、气血均有调节作用。本实验选取进行注射的穴位均位于督脉，百会穴位居巅顶，为“三阳五会”，具有疏通督脉经气、振奋阳气、醒脑开窍等功效。大椎穴是手足三阳经与督脉的交会穴，是阳气汇聚点，刺激大椎穴不仅可以调节督脉经气，更是可以调节六阳经之经气，具有通督止痉、强壮全身阳气的作用[10]。二穴配伍具有疏通经络、行血化滞、调畅气机、通督止痉之功效。大量实验研究证实,针刺以上两穴能够改善脑部血液循环，进而治疗包括癫痫病在内的多种中枢神经系统疾病[11-14]。

穴位注射，又称为“水针”, 是一种针药并用的中医特色综合治疗方法，通过针灸与药物相结合而发挥治疗效果，其理论依据来源于穴位和经络治疗作用及药物的药理作用。本实验选用的药物为天麻素，借助穴位注射这一治疗手段，通过对特定腧穴进行刺激，最终起到改善患者机体功能的作用[15-17]，进而对癫痫起到逐步治疗的作用。

研究显示，癫痫发作可致使大脑神经元损伤，海马神经元损伤又对癫痫的发生起着重要作用，因此，减少癫痫后海马神经元损伤是避免癫痫反复发作、逐渐加重的一个重要途径[18-19]。具有独特超微结构的线粒体，其功能主要为能量转换，对维持神经元正常生理功能具有重要作用。中枢神经系统的线粒体功能障碍可以导致癫痫的发作，癫痫的发作也可引起线粒体的损伤[20]，因此探讨如何减轻癫痫后脑损伤可以从减少线粒体神经元损伤方向入手。

此外，本实验其他检测指标的选择主要基于以下考量：海马在学习、记忆等认知功能的形成方面扮演着重要角色[21]，从海马损害角度评价癫痫后认知障碍程度的诸多行为学实验中，Morris水迷宫最为适合，在检测大鼠空间学习、记忆力方面也最为经典[22]。众所周知，在癫痫病的诊断、治疗及预后评价方面，脑电具有非常重要的价值。在形态学研究中，在研究超微结构时，通过电镜可反映出损伤的分布和范围，由此对损伤程度可进行评定。

研究结果显示，经干预后模型组ECG波幅和频率明显比空白组波幅增高；而西药组波幅和频率、穴注组波幅和频率明显较模型组降低。由此可见PTZ造模可产生高波幅、高频率的异常脑电图，而丙戊酸和天麻素穴注可对脑电波起到一定的修复作用，降低癫痫大鼠的脑电波幅及频率。Morris水迷宫实验显示，模型组潜伏期明显较空白组延长、穿越平台数减少，证明造模后癫痫大鼠认知已经出现了障碍，记忆力减退。穴注组和西药组与模型组比较，两组潜伏期明显缩短，穿越平台次数增加，表明穴注和西药均可对癫痫大鼠认知、记忆力有一定的改善作用。电镜下海马CA3区线粒体半定量损伤评分显示，模型组损伤程度以4级居多，而穴注组和西药组损伤程度4级、3级参半，表明两组较模型组比较损伤程度有所减轻。且各实验结果均可见，西药组与穴注组数据进行统计分析比较时P>0.05，即在脑电波修复、认知记忆改善及减缓线粒体损伤方面，穴注天麻素效果与丙戊酸相当。

综上，本实验从行为学、脑电及线粒体超微结构三方面入手，最终证实天麻素穴注对癫痫大鼠的脑保护作用疗效确切，为临床抗癫痫、改善癫痫后认知状况提供了新思路，其机理值得进一步探讨。