基因治疗中的穿膜肽转染机制

王鹤

【摘 要】基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗疾病的目的。基 因治疗 的策略主要包括：对有缺 陷的基因进行修复，或者用正常的基 因替换致病基因 ， 纠正人 自身基 因功能和表达 的紊 乱 二 通过反义技术及RNA干扰技术抑制 有害基 因的表达 三 利用导入的外来基 因的表达产物 ， 弥补缺陷细胞 的功能等 约有 70%的基因治疗临床试 验应用的是病毒载体，相比之下，非病毒型基因载体穿膜肽免疫原性较低，且价格低廉，易实现规模化生产，是目前被广泛研究的一种基因载体。

【关键词】基因治疗;穿膜肽载体

一、引言

约有 70%的基因治疗临床试 验应用的是病毒载体但病毒 载体 的应用 仍然受到如 下 因素 的限制 制备 困难 、 目的基 因容量小 、靶 向特异性差 、 免疫原性较强 、易产生野 生型病毒等 。同时 ， 在细胞水平 ， 病毒转染后会导致细胞表面标志的明显改变 ， 致使再次应用该类细胞的可能性降低 。尤其是在早年美 国发生 了一起 因腺病毒介 导基 因治疗鸟氨酸氨 甲酞转移酶缺 陷症 引起免疫并发症死亡 的案例后所以从安全医用的角度考虑还是不宜用于基因治疗。相比之下，非病毒型基因载体免疫原性较低，且价格低廉，易实现规模化生产，是目前被广泛研究的一种基因载体。

二、穿膜肽载体的作用机制

穿膜肽载体被广泛用于递送DNA、mRNA和双链RNA这些带有大量负电荷的水溶性大分子与各种载体结合，经过共价键连接、包裹或通过静电相互作用结合成纳米颗粒等方式负载在非病毒载体上，通常形成载体/核酸复合物直径在几十到几百纳米不等。这些纳米复合物的理化性质对转染效率有较大影响非病毒载体/核酸复合物经静脉注射进入血液循环，首先面临的挑战是在血液和细胞外间质中各种核酸内切酶降解。因此，非病毒载体负载核酸需要能够保护其不被酶降解非病毒载体/核酸复合物经内吞途径进入细胞，被包裹于内涵体（endosome）中，ATP介导的质子泵作用使内涵体和溶酶体中积累了大量的质子，呈现明显的酸性非病毒载体需要介导核酸分子逃逸出内涵体，避免在内涵体和溶酶体中降解。复合物在内涵体中解离后基因游离到胞浆中，进而通过胞核孔进入核中进行表达，最后转录得到蛋白质进而调控细胞及组织生长。

三、穿膜肽载体转染研究进展

1.迄今发现，非病毒载体实现内涵体逃逸的机制有两种：一种是质子海绵膨胀机制，利用内涵体内部的酸性条件，在转染过程中加入具有 pH缓冲作用的分子，使内涵体不断吸收质子，最终涨破导致基因/载体复合物逃逸经典的聚合物诱导的质子海绵效应其中核酸释放依赖于通过聚合物和内部内体膜的紧密结合的时间依赖性质子化诱导的膜透化另一种内涵体逃逸机制是借鉴病毒和细菌逃逸内涵体的原理，利用疏水性基团、双亲性结构分子与磷脂双层膜融合、打孔或裂解等方式实现。

2.反转胶束模型中，碱性残基会与质膜中带负电荷的磷脂之间相互作用，随后疏水性残基与膜核心的相互作用诱导双分子层的扰动，形成负曲率伴随相邻脂质的重组形成反转胶束进而将肽包埋在内部，膜破裂释放肽进入到细胞内侧。认为经典的脂质混合机制通过脂质复合物和宿主内体膜的膜融合进行，然后将带负电荷的磷脂从细胞质交换到内体的内表面。结果发生膜去稳定化和核酸释放。相反，脂质混合可以起作用一种改变的机制，其中靠近内-内膜的脂质复合物通过扩散或降解失去脂质分子。脂质分子的释放允许核酸的被动释放，随后是由释放的脂质的整合导致的瞬时孔形成介导的随后的细胞质转运。

3.所有这些模型的第一步都需要带正电荷的CPPs与带负电荷组分（如硫酸乙酰肝素HS和磷脂双层）的细胞膜相互作用，使CPPs与脂质双分子层绑定然后导致质膜的暂时不稳定，阳离子透膜肽介导核酸分子进入细胞的过程如图12所示，阳离子透膜肽与细胞膜外带负电荷的糖胺聚糖（GAG）基质如肝素等结合，小部分直接转导进入细胞，绝大部分插入到细胞膜经各种蛋白（如小窝蛋白、网格蛋白）介导的内吞或大包吞作用进入细胞。

4.小分子-CPP缀合物中的接头的实例。用于小分子CPP的稳定接头包括硫醚键，其通过使用马来酰亚胺反应性基团实现，三唑接头通，和酰胺键使用碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯。可裂解酶包括在酸性pH下裂解的那些，例如通过醛与酰肼反应获得的腙键，和通过柠康酐与胺反应获得的顺式酰胺连接子。还使用在还原条件下裂解的两种硫醇之间形成的二硫化物接头针对CPP-药物递送系统的掩蔽策略的实例由于它们的高阳离子电荷，CPP是非特异性的内化于许多类型的细胞和组织中。当与其他主动定向方法结合使用时，这种非特异性分布可能会超过目标识别。克服这个问题的一种方法是屏蔽CPP直到复何物到达的目标站点寡聚精氨酸的阳离子电荷通过蛋白酶敏感肽序列或過氧化氢敏感基团与低聚谷氨酸的连接而被掩盖裂解后，寡精氨酸和低聚谷氨酸解离，显示出低聚精氨酸的阳离子电荷或者通过与组氨酸-谷氨酸共聚物序列连接掩蔽CPP的阳离子电荷。

四、结论

透膜肽/核酸复合物的尺寸对细胞透膜机制有较大影响，部分较小尺寸的复合物可以直接转导进入细胞，而随着复合物尺寸的增大，小窝蛋白、网格蛋白介导的内吞作用和大包吞作用呈逐渐增多趋势通过球蛋白介导的内吞作用将直径约120nm的纳米颗粒内化到细胞中，通过网格蛋白介导的内部化50-70nm的颗粒。通过肌动蛋白对较大的颗粒被大胞饮作用内化。

【参考文献】

1. L. Naldini， Nature， 2015， 526， 351–360.

2. M. A. Kay， J. C. Glorioso and L. Naldini， Nat. Med.， 2001， 7， 33–40.

3. E. Ruoslahti， Adv. Mater. ， 2012， 24， 3747–3756.

4. I. M. Verma and N. Somia， Nature， 1997， 389， 239–242

5. D. Ibraheem， A. Elaissari， and H. Fessi.， Int. J. Pharm.， 2014， 459， 70–83.

6. M. A. Kay， J. C. Glorioso and L. Naldini， Nat. Med.， 2001， 7， 33–40.

7. M. A. Mintzer and E. E. Simanek， Chem. Rev.， 2009， 109， 259–302.