两种HCV RNA定量检测方法的临床对比研究

彭亚柏 彭雅兰 管吉鹏 王敏

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的病毒性肝炎，简称丙型肝炎或丙肝，通过血液传播、性传播、母婴传播等其他途经传播。丙型肝炎病毒是单股线性正链RNA 病毒，是黄病毒科唯一的嗜肝病毒。世界卫生组织统计表明，丙肝已是一种全球性流行感染病，目前全世界约有1.7 亿人感染HCV，感染率是3%左右，丙肝每年新发病例达到3.5 万例［1］，且不同年龄、性别、种族均易感HCV［2-4］。现阶段暂无针对丙肝的疫苗，缺乏足够的治疗手段，并且因为HCV的生物学特点与感染者自身免疫功能等多方面因素影响，机体难以有效的清除病毒，所以早诊断、早发现、早治疗对于丙型肝炎的防治和积极阻断转播途径相当重要［5］。血清中的HCV RNA 是病毒复制和肝炎进程的确切标志，被称为诊断HCV 感染的“黄金标准”［6］。本研究收集了132 例血清标本，同时用某国产丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量检测（简称国产试剂）和某进口（简称进口试剂）2 种试剂，用于评价并对比分析了2 者检测结果的相关性和一致性，了解其在丙型肝炎早期诊断中的价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集在2019年1月至5月于深圳市第三人民医院诊治的慢性丙型肝炎患者的临床检测剩余血清标本，保存在-80℃条件下。诊断均符合《2015版慢性丙型肝炎防治指南》［7］中慢性丙型肝炎的诊断标准。男76 例，女56 例；最大年龄78 岁，最小年龄22 岁，平均年龄（44.68±12.96）岁。

1.2 方法

每份样本同时使用进口试剂和国产试剂进行平行检测，操作过程严格按照说明书中标准步骤进行。2 种检测方法在检测原理上基本一致，均采用磁珠法提取和纯化核酸，核酸扩增均采用Taqman 实时荧光定量聚合酶扩增技术对血清中HCV病毒载量进行检测［8-9］。采集血清至1.5 mL 灭菌离心管，采用核酸提取或纯化试剂对样本进行核酸提取，从试剂盒中取出HCV 反应液，室温融化后振荡混匀，按比例配制反应液，之后将20 μL 配制反应液分装到PCR 管中，往上述HCV 反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HCV 阴性质控品、HCV 强阳性质控品、HCV 临界阳性质控品和HCV 阳性定量参考品40 μL。盖紧管盖，8 000 rpm 离心数秒后转移至扩增检测区扩增。2 种检测试剂盒的详细参数，见表1。

1.3 统计方法

应用Graphpad 整理数据，使用R 3.6.0 分析及绘图，采用配对t检验分析2 种检测方法结果的差异，采用相关分析法分析不同试剂检测结果的相关性，采用Bland-Altman 模型分析2 种检测方法结果的一致性。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种试剂检测结果的比较

国产和进口试剂检测结果均高于检测下限的样本为114 例，均低于检测下限的样本6 例，检测结果一致性较高，达到90.91%（120/132）。进口检测结果中高于检测下限样本共114 例，占比86.36%（114/132）；国产试剂检测结果中高于检测下限的样本共126例，占比95.45%（126/132）。2种试剂检测结果的不符合率分别为9.52%（12/126）和0%（0/114）。结果不符合的12 例样本中，检测结果＜100 IU/mL 的比例为8.33%（1/12），2 种试剂差值超过1 个log（6.25倍）的有12 例，均为国产试剂高于进口试剂。

表1 2 种测试剂的参数对比Table 1 comparison of parameter data between 2 reagents

2.2 2 种试剂检测结果的对比分析

国产和进口试剂检测结果均高于下限的114例样本的平均HCV 血清病毒载量分别为（2.38×104～5.6×106）IU/mL 和（5.47×106～1.39×107）IU/mL，配对t检验显示两者差异具有统计学意义（t=-3.32，P=0.001）（见图1）。根据进口试剂的检测结果，分别对＜1 000 IU/mL 组和＞1 000 IU/mL 组的数据进行配对t检验。结果表明当病毒载量＞1 000 IU/mL 时，2 种检测试剂的结果差异有统计学意义（t=-2.45，P=0.02）（见图2），在病毒载量＜1 000 IU/mL 时差异也具有统计学意义（t=-2.30，P=0.03）（见图3）。

图1 2 种试剂检测的HCV 病毒载量的对比分析Figure 1 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

图2 2 种试剂检测的HCV 病毒载量的对比分析Figure 2 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

图3 2 种试剂检测的HCV 病毒载量的对比分析Figure 3 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

2.3 2 种试剂检测结果的一致性分析

将2 种方法检验结果均大于下限的114 个病毒载量值，取对数后进行相关性分析，相关系数r=0.98，P＜0.001，表明两者具有很强的相关性（见图4）。差异分析显示，进口试剂与国产试剂定量值差异平均值96%（109/114）的样本检测值在95%的可信区间内，表明进口与国产具有较高的一致性（见图5）。

图4 2 种试剂检测的HCV 病毒载量的对比分析Figure 4 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

图5 2 种试剂检测的HCV 病毒载量一致性分析Figure 5 Consistency analysis of HCV virus load detected by 2 reagents

3 讨论

HCV RNA 是临床诊断丙肝的金标准，具有早期、特异、灵敏等优点，在丙肝感染早期诊断、进程评估、疗效检测等方面发挥了重要作用［10-12］，其中早期临床诊断对丙肝及相关疾病的治疗和预后极其重要。血液传播是HCV 的主要传播途径，同时也是病毒性肝炎发生的主要因素之一［13］。从发病机制看，当HCV 进入人体内时，其会诱发病毒血症，同时在肝细胞内大量复制，阻碍细胞内的大分子合成，增加溶酶体膜通透性，进而导致细胞的病变，同时导致机体内肝脏等多器官损害［14］。目前临床通过注射疫苗的方式来预防甲型肝炎病毒与乙型肝炎病毒，然而目前尚无针对丙型肝炎病毒与丁型肝炎病毒疫苗，因此合理的筛查对于丙肝的临床诊治意义重大。

随着医疗环境的改善，特别是随着新医改方案出台，临床的血液供量不断增加，为了保证用血需求，减少血源的浪费，降低检测的假阳性率，有必要探索具备较高特异性及敏感性的检测方法［15］。本研究选择用进口试剂与国产试剂对比，是因为2 种试剂检测原理相同，都基于实时荧光定量PCR；通过这样的研究可以进一步了解国产试剂的具体性能。

在本次研究中，国产和进口检测结果均高于检测下限的样本为114 例，均低于检测下限的样本6 例，检测结果一致性较高，达到90.91%（120/132）。虽然工作原理相同，国产试剂检测结果大于检测下限的样本比例稍高于进口试剂；国产试剂检测结果的不符合率也高于进口试剂，国产试剂线性范围下限是20 IU/mL，而进口试剂的15 IU/mL 稍低于国产试剂，尽管如此，检测结果不相符的12 例样本中8.33%（1 例）病毒载量小于100 IU/mL，对于临床监测治疗效果和预测耐药发生无影响。

通过深入分析检测结果，我们发现2 种试剂检测的病毒载量值在＞1 000 IU/mL 的样本中差异显著，而在＜1 000 IU/mL 的样本中，不仅差异显著还呈现了负相关性。

尽管2 种试剂的检测结果具有较高的一致性，两者相关系数达到0.98，仍有12 例样本的检测结果差异超过1 个log（6.25 倍），推测可能是试剂靶点的不同导致了该差异出现，HCV 在不同样本中的序列存在一定的差异性，也会导致不同的实际检测效能存在一定的差异。

综上所述，在丙型肝炎临床诊断中，国产与进口试剂均有其各自的优缺点，且2 者具有较高的一致性，适合临床监测抗病毒治疗效果。国产试剂特异性高，便于操作，容易上手，性价比较高，同时对检验人员技术水平和仪器设备无特殊要求；而进口试剂具有灵敏度高，影响因素少，结果准确，更适合于窗口期感染者筛查，可以将其当作早期诊断HCV 感染的有效检测方法。因此在临床上应根据患者具体情况对丙型肝炎病毒抗体检测中选用针对性强的检测方法。

世界卫生组织号召全人类行动起来，至2030年可以全面消灭慢性乙型/丙型病毒性肝炎对人类造成的健康威胁，从而使全世界的病毒性肝炎新发感染人数能减少90%。总所周知从传染源上阻断病毒的传播扩散，对控制疾病以及降低发病率意义重大，故采取有效的HCV RNA 定量检测方法，并将其灵活运用至临床中具有重大意义。