HPLC法测定人参花茶和人参花红茶中13种人参皂苷含量

董庆海，王涵，曹莹，杨录军，崔宝仁，王清，刘金平，李平亚，王松※

（1.吉林大学药学院，长春 130021；2.吉林紫鑫药业股份有限公司，长春 130022；3.抚松县晟宏生态人参有限公司，吉林 白山 134500）

人参（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科人参属多年生草本植物，被《神农本草经》列为上品，有“百草之王”的美誉[1]，主要生长在我国东北地区[2]。人参花系人参未开放的花蕾，又名“神草花”，呈暗绿色，质脆，易碎，气香，性温和，味甘微苦，有清热消炎、平肝清火、解毒利咽、降血压等功效，是天然的补品，素有“绿色黄金”之称[3-4]。每株人参仅开1 朵花，每年6月中旬左右人参花蕾才能孕育成熟，此时方可采摘[5]。近年来，随着对人参花研究的不断深入，发现人参花中人参皂苷的含量是根的5 倍[6]，参与调节机体的免疫网络，增强免疫力[7]，但不含Ro皂苷，服用不会使人上火[8]，挥发油含量也高于根、茎[9]，人参总多糖含量是根的2～5倍[5]，此外，人参花有其特有成分，人参花蕾9 肽和人参花蕾11 肽属于小分子，极易吸收，可快速准确地识别机体内的cAMP-cGMP平衡，使人体维持健康状态[10]。

通过人工采集人参花，经日晒、烘干、发酵等工艺，可制成人参花茶和人参花红茶，风味独特，营养价值极高，充分发挥了人参花的保健作用。人参花茶和人参花红茶作为一种新兴保健饮品，市场前景巨大，然而，在《中国药典》中只记载了人参根和人参叶的质量控制标准，并未见关于人参花及人参花茶的质量控制标准。因此，本研究应用HPLC 法建立了人参花茶和人参花红茶中13 种人参皂苷的定性、定量分析方法，旨在为其质量控制和评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

98-1-B 型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海豫康科教仪器设备有限公司）；FA1104N 型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；ACchrom S6000 型高效液相色谱仪（华谱新创科技有限公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，美国Fisher 试剂公司）；甲醇（分析纯，天津新通精细化工有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；纯净水（白山娃哈哈饮料有限公司）；人参皂苷Rg1、Rc、Rb2、Rb3、F1、F2、Rb1、Rh1对照品（吉林大学化学学院自制）；人参皂苷CK 对照品（中国药品生物制品检定所）；人参皂苷Re、Rg2、Rd、Rg3对照品（吉林大学天然药物研究中心自制）。

人参花茶1 号、2 号、3号（生产日期为2018.12.10）和人参花红茶 4 号、5 号、6 号（生产日期 2019.01.10），均由吉林紫鑫药业提供。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

称取人参皂苷对照品适量，置于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，配制成Rg1（0.68mg/mL）、Re（0.74mg/mL）、Rh1（0.36 mg/mL）、Rg2（0.42 mg/mL）、Rb1（0.16 mg/mL）、Rc（0.3 mg/mL）、F1（0.1 mg/mL）、Rb2（0.44 mg/mL）、Rb3（0.36 mg/mL）、Rd（0.38 mg/mL）、Rg3（0.24 mg/mL）、F2（0.22 mg/mL）、CK（0.26mg/mL）的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

平行称取人参花茶、人参花红茶4 g 2 份，加水煎煮2 次，每次100 mL，每次2 h，煎液滤过合并，通过D101 型大孔树脂柱，上样吸附4 h。用水洗脱至无色，再用60%乙醇洗脱至无皂苷反应，收集60%乙醇洗脱液[11]，浓缩，85℃蒸干，在250 mL容量瓶中甲醇定容，0.45um针式过滤器滤过，取续滤液，即得供试品、平行供试品。

2.3 色谱条件

色谱柱：Unitary C1（8250 mm×4.6 mm，5um）；柱温：30℃；检测波长：203nm；流速：1.3mL/min；进样量：10uL；流动相：乙腈 0.05%磷酸水溶液；梯度洗脱[12]（表1）。

表1 流动相洗脱梯度程序Table 1 Mobile phase elution gradient program

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度 取同一批人参花茶供试品溶液，在“2.3”项下测定，连续进样5 次。计算13 种人参皂苷峰面积的相对标准偏差（RSD），RSD 为0.86%～2.87%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 重现性 取同一批次人参花茶样品，按“2.2”项方法制备5 批供试品溶液，在“2.3”项下测定，连续进样5次。计算13 种人参皂苷峰面积的相对标准偏差（RSD），RSD 为0.76%～2.94%，表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性 取同一人参花茶供试品溶液，在“2.3”项下测定，分别在 2、4、6、12、24h 进样。计算 13 种人参皂苷峰面积的相对标准偏差（RSD），RSD为0.89%～2.93%，表明供试品在24 h 内稳定。

2.4.4 加样回收率 称取同一人参花茶样品1 g 3 份，分别置于具塞锥形瓶中，分别加入一定量人参皂苷混合对照品溶液，按照供试品制备方法制备后测定。样品加样回收率在94.1%～103.4%，RSD 为0.97%～5.32%。

2.4.5 线性关系 吸取混合对照品溶液4、6、10、15、20uL 分别进样，记录HPLC 谱图。以对照品的量（ug）为横坐标、对照品的峰面积为纵坐标进行线性回归分析，结果见表2。

表2 单体人参皂苷峰面积-含量线性回归方程和相关系数Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of monomer ginsenoside peak area-content

2.5 样品含量测定

取不同批次的人参花茶、人参花红茶，按“2.2”项下方法制备，在“2.3”项下测定，混合标准品及人参花茶、人参花红茶的HPLC 色谱图见图1，测定13 种人参皂苷含量的结果见表3。

图1 混合标准品及人参花茶、人参花红茶样品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard，ginseng flower tea and ginseng flower black tea samples

表3 人参花茶和人参花红茶样品的人参皂苷含量Table 3 Ginseng saponin content of ginseng flower tea and ginseng flower black tea samples （mg/g）

3 结论与讨论

本研究依据《中国药典》2015年版（一部）人参茎、叶总皂苷的制法，制备人参花茶和人参花红茶的供试品溶液，在最大程度保留人参皂苷的同时，去除其他杂质。本试验采用HPLC 法，建立了2 种人参花茶6 组样品中13 种人参皂苷类成分的定性、定量分析方法，涵盖了绝大多数人参皂苷成分，能够系统全面地鉴定人参花茶中人参皂苷的种类及含量。结果表明，2 种人参花茶均含有13 种人参皂苷。人参花茶和人参花红茶中人参皂苷Rd、Re、Rc、Rg2的含量存在差异，人参花茶中人参皂苷Rd、Re、Rc 的含量高，人参花红茶中人参皂苷Rg2的含量高，是区分2 种花茶的重要标准之一。人参花茶和人参花红茶样品均含有丰富的人参皂苷营养成分及功能因子，但二者之间也存在一定的差异，与这2 种花茶的制作工艺有关。

本试验建立的HPLC 检测方法，能在同一色谱条件下同时对人参花茶和人参花红茶中13 种主要人参皂苷的含量进行测定，建立了同一色谱条件测定多种人参皂苷类成分含量的测定方法。本方法简便、快捷，且分析结果全面可靠，为人参花茶和人参花红茶质量标准的建立提供了科学依据。