麝香壮骨膏对诱导型佐剂关节炎的作用机制研究

许艳茹，石菊，展月，李敏，唐晓桐，王雅俪，徐建※

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，长春 130012；2.修正药业集团股份有限公司，吉林 通化 134000）

麝香壮骨膏药方源于《皇帝内经》，已经有2 000多年的历史[1]。麝香壮骨膏处方由麝香、薄荷脑、冰片等17 味药材组成，功能主治镇痛、消炎，用于风湿痛、关节痛等病症。风湿病关节炎（RA）是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。大鼠佐剂关节炎模型是一种典型的免疫性炎症模型，是目前最经典、应用最广泛的RA 实验方法[2-3]。本品临床应用广泛，但未见其药效学研究报道。本试验对大鼠足趾皮下注射弗氏完全佐剂来建立大鼠关节炎模型，对小鼠腹腔注射冰醋酸来建立腹膜炎模型，观察麝香壮骨膏对其药效作用。

1 材料

1.1 动物与仪器

ICR 小鼠（雌、雄各半，6～8 周龄，体重 18～22 g）、Wistar 大鼠（雄性，体重 240～260 g）（长春市亿斯实验动物技术有限责任公司）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；低速离心机（LD5-2A 型，北京医用离心机厂）；电子天平（JA0311N型，上海民桥精密科学仪器有限公司）；弗氏完全佐剂（CFA）（SLBD0736，SIGMA公司）；类风湿因子（RF）、骨保护素（OPG）、核因子（NF-kB）试剂盒（批号20171229）；白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子（TNF-a）试剂盒（批号：20180115）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 药物

麝香壮骨膏（批号：20170905）、阴性基质贴（修正药业集团股份有限公司）；麝香壮骨膏（批号20161105，黄石卫生材料药业有限公司）作为阳性对照药。

1.3 剂量设计

按照中国药典标准，剂量以临床剂量折算获得，根据含膏量及药物与基质的比例计算得出给药面积。

2 方法[4]

2.1 大鼠佐剂关节炎试验

从60 只雄性大鼠中随机取10 只作为空白对照组，其余50 只大鼠进行造模：以75%乙醇消毒后，右后足垫皮内注射CFA0.1 mL/只，制备佐剂性关节炎模型，空白对照组以同样方法注射生理盐水0.1mL/只。造模7 d 开始分组给药，分别为空白对照组、模型对照组（给予基质贴剂）、阳性对照组（64 mg/kg）、麝香壮骨膏低、中、高剂量组（32、64、128 mg/kg），取贴膏剂贴服于大鼠足趾部位，用橡皮膏固定，每天换药1 次，连续给药14 d。

使用游标卡尺分别于造模前、造模后2、5、10、21 d测量大鼠右后足趾肿胀度，参照张钧天[4]方法评估关节炎指数（Arthritis index，AI）。于造模后 2、5、10、21 d 观察并记录全身关节病变程度，标准如下：0 分，无红肿；1 分，小趾关节红肿；2 分，趾关节和足趾肿胀；3 分，踝关节以下的足爪肿胀；4 分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。将各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI，最高分为12 分。采用酶联免疫法检测大鼠血清中RF、TNF-a、IL-17、NF-kB 以及OPG 水平。取下右后肢足趾，10%中性甲醛固定，光镜下观察用药前、后大鼠关节腔内滑膜的变化，比较关节组织的病理形态学变化。

2.2 小鼠腹膜炎试验

取小鼠 60 只，雌、雄各半，体重 18～22 g，随机分成空白对照组、模型对照组（给予基质贴剂）、阳性对照组（137 mg/kg）及麝香壮骨膏低、中、高剂量组（46、137、228 mg/kg），每天换药1 次，连续7 d。末次给药后，各鼠均静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液10 mL/kg，并立即腹腔注射0.7%冰醋酸10 mL/kg。注射冰醋酸后15 min 处死小鼠，用生理盐水冲洗腹腔，收集全部冲洗液至5 mL，3 000 r/min 离心 10 min 后，取上清液于630 nm 波长处测定其OD 值，以OD 值表示冲洗液中伊文思蓝的浓度，依据伊文思蓝标准曲线计算伊文思蓝渗出量，间接反映腹膜炎性渗出的程度。

2.3 数据统计与分析

试验数据使用SPSS19.0 统计软件进行统计分析，采用t检验数据显著性分析，结果均以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 大鼠佐剂关节炎试验结果

3.1.1 对大鼠足趾肿胀度的影响 造模后模型对照组大鼠足趾肿胀度明显增加，与空白对照组相比有极显著差异（P＜0.001），说明模型成功。各给药组在10、21 d 时能够明显抑制足趾肿胀度，与模型对照组有显著差异（P＜0.05），提示麝香壮骨膏能明显抑制肿胀度，减轻佐剂性关节炎大鼠的炎症反应（表1）。

3.1.2 各组大鼠关节炎指数的变化 造模2 d 后，除空白对照组外，其余组大鼠表现出不同程度的关节炎症，提示造模成功。随着时间的延长，模型对照组大鼠的关节损伤加重，关节炎指数逐渐上升。用药后各给药组在造模10～21 d 关节炎指数均明显降低，与模型对照组相比有显著差异（P＜0.05），提示麝香壮骨膏能降低关节炎指数，减轻佐剂性关节炎大鼠的炎症反应（表2）。

表1 各组大鼠右后足趾肿胀度的变化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats （±s，n=10）

表1 各组大鼠右后足趾肿胀度的变化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats （±s，n=10）

注：###.空白对照组相比，在 0.001 水平上差异极显著（P＜0.001）；*、**、***.与模型对照组相比，在 0.05、0.01、0.001 水平上差异显著或极显著。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P＜0.001);*,**,***.Significant differences with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

肿胀度（mm）Swelling degree组别Group剂量（mg/kg）Dose 造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白对照组Blank control group ― 0.05±0.08 0.12±0.15 0.04±0.10 0.11±0.29模型对照组Model control group ― 3.93±0.81### 3.51±0.77### 2.05±0.62### 1.74±0.51###阳性对照组Positive control group 64 3.63±0.76 3.14±0.69 1.54±0.53* 1.26±0.54*低剂量组Low-dose group 32 3.46±0.71 3.06±.73 1.03±0.61** 1.29±0.51中剂量组Medium-dose group 64 3.39±0.97 2.89±0.81 1.18±0.37** 1.07±0.43**高剂量组High-dose group 128 3.44±0.54 3.02±0.64 1.43±0.33* 1.23±0.30*

表2 各组大鼠关节炎指数的变化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group （±s，n=10）

表2 各组大鼠关节炎指数的变化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group （±s，n=10）

注：###.与空白对照组相比，差异极显著（P＜0.001）；*.与模型对照组相比，差异显著（P＜0.05）。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P＜0.001)；*.Significant difference with model control group(P＜0.05).

组别Dose剂量（mg/kg）Dose造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白对照组Blank control group - 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00模型对照组Model control group - 3.8±0.42### 4.7±1.25### 5.9±1.29### 6.1±1.45###阳性对照组Positive control group 64 3.6±0.52 4.7±0.82 4.4±1.17* 4.7±0.67*低剂量组Low-dose group 32 3.5±0.53 4.6±0.97 4.7±1.16* 4.6±0.97*中剂量组Medium-dose group 64 3.7±0.48 4.6±0.70 4.6±1.17* 4.7±1.16*高剂量组High-dose group 128 3.6±0.52 4.5±0.97 4.7±1.16* 4.7±0.95*

3.1.3 麝香壮骨膏对各组大鼠血清生化指标的影响模型对照组大鼠血清OPG 含量明显降低，RF、NF-kB 释放量明显增加，与空白对照组相比有显著差异（P＜0.05）；麝香壮骨膏能明显促进OPG 生成（P＜0.05），低、中剂量麝香壮骨膏抑制血清RF、NF-kB 的表达释放（P＜0.05），提示麝香壮骨膏对关节炎有保护作用，能减轻类风湿的发生。结果见表3。

模型对照组大鼠血清TNF-a和IL-17 含量与空白对照组相比极显著增加（P＜0.01），低、中、高剂量麝香壮骨膏明显抑制大鼠血清TNF-a释放（P＜0.05），低、中剂量麝香壮骨膏对血清IL-17 含量的抑制作用显著（P＜0.05）。结果见表4。

表3 麝香壮骨膏对大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影响Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats （±s，n=10）

表3 麝香壮骨膏对大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影响Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats （±s，n=10）

注：#、###.与空白对照组相比，在 0.05 和 0.001 水平上差异显著；*、**、***.模型对照组相比，在 0.05、0.01 和 0.001 水平上差异显著Note:#,###.Significant difference with blank control group at 0.05 and 0.01 levels;*,**,***.Significant difference with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

组别 Group 剂量 Dose（mg/kg） OPG（pmol/L） RF（ng/L） NF- B（ng/mL）空白对照组 Blank control group - 332.0±114.9 32.6±2.43 16.4±4.53模型对照组 Model control group - 173.5±45.7### 41.7±12.70## 22.2±5.16#阳性对照组 Positive control group 64 342.1±111.8*** 37.8±9.47* 17.8±6.04*低剂量组 Low-dose group 32 279.0±15.5*** 36.8±16.70* 16.1±4.90*中剂量组 Medium-dose group 64 262.3±116.2* 38.5±6.60* 16.8±6.18*高剂量组 High-dose group 128 283.1±62.8** 39.7±2.95 18.8±4.56

表4 麝香壮骨膏对大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影响Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats （±s，n=10）

表4 麝香壮骨膏对大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影响Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats （±s，n=10）

组别 Group 剂量 Dose（mg/kg） TNF-（ng/L） IL-17（ng/L）空白对照组 Blank control group - 97.8±62.1 44.3±14.2模型对照组 Model control group - 156.8±65.6## 77.8±33.6##阳性对照组 Positive control group 64 124.2±63.4* 57.4±29.9*低剂量组 Low-dose group 32 86.9±53.8*** 47.6±18.2**中剂量组 Medium-dose group 64 115.8±52.3** 59.1±16.6*高剂量组 High-dose group 128 128.8±46.4* 65.2±27.4

3.1.4 关节滑膜软组织的病理形态学变化 空白对照组大鼠的踝关节面光滑，关节腔内无渗出物，滑膜层由2～3 层滑膜细胞组成，排列规则，滑膜细胞下层为疏松结缔组织，未见滑膜增生；模型对照组大鼠踝关节滑膜细胞显著增生，排列絮乱，有大量炎性细胞浸润，结缔组织严重充血，血管翳形成，节腔隙变窄，炎性渗出；麝香壮骨膏中剂量组踝关节面光滑，滑膜细胞增生减少，细胞浸润减轻，滑膜下疏松结缔组织中度充血，关节腔未见狭窄；麝香壮骨膏低、高剂量组以及阳性对照组滑膜轻度增生，少量细胞浸润，滑膜下疏松结缔组织中度充血，关节腔轻度狭窄。结果见图1。

3.2 小鼠腹膜炎试验

由表5可知，模型对照组伊文思蓝的炎性渗出量明显增加，麝香壮骨膏低、中、高剂量组小鼠腹腔伊文思蓝的炎性渗出明显减少，与模型对照组相比有显著差异（P＜0.05），表明麝香壮骨膏可以抑制炎性渗出的发生。

图1 各组大鼠关节滑膜软组织的病理形态学变化Fig.1 Pathomorphological changes of synovial soft tissue in each group of rats

表5 麝香壮骨膏对各组小鼠腹腔伊文思蓝渗出量的影响Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group （±s，n=12）

表5 麝香壮骨膏对各组小鼠腹腔伊文思蓝渗出量的影响Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group （±s，n=12）

组别 Group 剂量（mg/kg） Dose 伊文思蓝渗出量（ g/mL） Exudative amount of Evans blue空白对照组 Blank control group - 0.163±0.012模型对照组 Model control group - 0.944±0.338###阳性对照组 Positive control group 137 0.660±0.292*低剂量组 Low-dose group 46 0.680±0.192*中剂量组 Medium-dose group 137 0.560±0.102**高剂量组 High-dose group 228 0.672±0.253*

4 讨论

炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进、渗出和水肿[5-6]，麝香壮骨膏可以抑制小鼠腹腔毛细血管通透性，对炎症有较好的抑制作用。NF-kB 是炎症反应中至关重要的调控器[7-8]；破骨细胞是RA 骨破坏进程中发挥关键作用的细胞，是介导滑膜局部炎症的关键细胞之一[9-11]，近年来研究发现，它也是参与关节破坏的主要效应细胞[12-13]。在骨代谢中，RANK/RANKL/OPG系统涉及成骨细胞和破骨细胞的相互作用[14]，RANKL和OPG由骨祖细胞和成骨细胞合成分泌[15-16]，破骨细胞表面RANK 受体与分泌型RANKL 结合，诱导破骨细胞的分化，在破骨细胞性骨吸收中发挥重要作用。本研究发现，麝香壮骨膏通过抑制血清RF 的表达，有效提高了OPG 的表达水平，OPG与NF-kB 竞争性地结合到破骨细胞前体细胞上，降低与RANKLRANK 结合率，激活破骨细胞核因子-k（NF-kB）信号途径，促进TNF-a和IL-17 的表达和分泌，从而抑制破骨细胞性骨吸收而发挥作用。

麝香壮骨膏临床应用广泛，但其有效的作用机制未见研究报道，对RA 的治疗机制涉及多个方面。本研究主要就该方对大鼠关节损伤的保护作用进行了探讨，对RA 发病环节中其他因素的影响有待进一步研究。随着分子生物学和免疫学研究内容的深入与研究手段的发展，本方剂的抗RA机制会有待进一步探讨。