中草药中氨基酸的前处理及色谱法分析

李亚丽，朴向民，逄世峰，曲正义，王英平

（中国农业科学院特产研究所，长春 130122）

氨基酸是含有氨基的羧酸，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单元[1-2]。目前，已发现自然界中有300 余种氨基酸，其中，参与蛋白质合成的氨基酸有20多种，是基本氨基酸[3]。氨基酸在自然界中主要以游离态和结合态2 种形式存在。中草药中2 种氨基酸形式皆存在，且大多为人体必需氨基酸，除具有营养价值外，在发挥药效时亦起着不可或缺的作用[4]，如亮氨酸和缬氨酸等具有提高运动耐力、抗感染和修复组织作用。另外，非必需氨基酸亦可能有一定的药效价值，如牛磺酸虽不是机体蛋白质的构成成分，但是缺乏牛磺酸可引起多种心血管和中枢神经性疾病[5]。谷酰胺或含谷酰胺的肽能防止新生儿肠上皮细胞由氧化剂诱导的氧化[6]；其次，氨基酸含量的高低可作为中草药药性判别的依据[7]；而且，指标性氨基酸可用于定性鉴别中药材[8]。从目前氨基酸在人体中的代谢来看，20 余种氨基酸的摄入量比例不当时，会致使氨基酸总体利用率降低[5]。另外，某种氨基酸摄入量过大还会对人体构成危害，如大量食用谷氨酸可能会引起头疼和肩背痛等[9]。因此，中草药中氨基酸分析可为中草药鉴别、质量评估及其相关产品的开发利用提供理论依据。由于氨基酸含有氨基和羧基高极性基团，且一般具有挥发性低、无强发色基团等特点，其分离和检测极具挑战性。色谱法是氨基酸分析最有效和最常用的方法，分析前预处理是确保分析结果准确无误的关键环节之一。笔者拟对中草药中氨基酸的前处理及色谱方法进行总结评述，并对氨基酸的前处理和色谱分析方法的发展趋势进行展望，以期为今后氨基酸分析工作提供参考。

1 氨基酸高效液相色谱法分析前处理

1.1 粗氨基酸样品制备

如需准确无误地检测中草药中氨基酸含量，除了熟练操作仪器外，样品前处理是否得当和正确也是确保检测数据可靠的重要因素之一。结合态氨基酸和游离氨基酸的前处理方法大不相同[10]。

1.1.1 结合态氨基酸 对于全氨基酸分析，凡是以蛋白质或多肽形式结合的氨基酸均需进行水解处理。传统的氨基酸水解方法有酸水解法、碱水解法和酶水解法 3 种[11]。

酸水解法：酸水解法是最常采用的水解方法。标准的酸水解方法是在6 mol/L盐酸、110 ℃真空条件下水解24 h[12]。大量试验证明，蛋白质中某些氨基酸，尤其是含硫氨基酸易受氧气和多种化学试剂的氧化，因此，纯化水解试剂和水解前除尽水解管中的氧对于准确测定十分必要[13]。酸水解法的优点是盐酸可以通过加热方法蒸发掉，缺点是氨基酸易于与含醛基的化合物反应而致使溶液显褐色；另外，盐酸溶液中的重金属可能使氨基酸遭受破坏。

碱水解法：标准的碱水解方法是在 2.5 mol/L NaOH 或LiOH 介质中水解20 h。李远坤[14]首先利用碱提取酸沉淀法提取蛋白质，然后采用碱水解法对蛋白质进行降解，蛋白的水解率为30%左右。碱水解法的优点是水解液清亮，此过程色氨酸不受破坏，是测定色氨酸含量时常用的方法。但碱水解法缺点是水解后的氨基酸发生消旋作用，此过程还会释放出氨气和硫化氢；另外，丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和胱氨酸等会遭到不同程度的破坏。

酶水解法：酶是有机催化剂，在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。酶水解法优点是水解条件温和、无需特殊设备、氨基酸不受破坏，缺点在于水解不够完全，目前未能发现某一种酶能完全水解所有蛋白质；另外，与酸、碱水解法相比较，酶法水解氨基酸还需考虑酶试剂种类、量、温度和pH 等因素；而且，其水解时间较长。Vesper 等[15]在不同缓冲液、不同温度和水解时间条件下，对蛋白内切酶及蛋白酶催化水解进行了深入研究，发现蛋白内切酶的稳定性会随温度升高而下降，从而致使其水解度降低。因此，通常全氨基酸分析不推荐采用酶水解法。

目前，欧洲、日本和中国在植物蛋白水解生产上均采用酸水解法。此外，近年来发展的微波消解法用于结合态氨基酸的消解，其原理是通过能量传递，依靠分子间的极化而不是碰撞完成的。微波消解法由于水解时间短，适合大批量的样品前处理。与常规水解法耗时长（20 h以上）、耗能大、不利于快速检测大量样品等特点相比较，微波消解法具有明显的优势[16]。但是，此方法还有待于进一步研究。

1.1.2 游离氨基酸 游离氨基酸的样品在分析前必须进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白和脱色等处理。不同的样品诸如烘干样品和鲜样所需提取条件不尽相同。

烘干样品中游离氨基酸的提取：一般先需要干燥和粉碎处理。赵复中等[17]用75%～80%乙醇提取游离氨基酸，也有人用蒸馏水常温浸泡或加热回流提取[18]。为了提高游离氨基酸的提取率，提取过程一般重复2～3次，然后合并、过滤提取液并浓缩，即得到游离氨基酸粗提液。或者采用蒸馏水超声提取的方法或在室温下试样用50%乙醇微波萃取，然后离心、过滤，备用。

鲜样中游离氨基酸的提取：鲜样一般采用10%乙酸匀浆或研磨法进行提取[19]。鲜样中的蛋白酶能水解蛋白质，致使游离氨基酸含量大幅升高，因此，研磨需要在冰浴条件下进行。鲜样中可通过加入一定浓度的磺基水杨酸、醋酸铅或95%乙醇沉淀，借助离心或过滤的方法去除蛋白质，加入乙醚去除脂类，加入乙酸乙酯去除酚类物质等[20]。

1.2 氨基酸纯化

从植物原料中提取的氨基酸粗提液含有可溶性糖、色素、有机酸及其他杂质，需要对其进一步纯化方可准确测定[21]。目前，常采用沉淀法、超滤法、高速离心法和离子交换法等纯化方法，其中，732 阳离子交换树脂法是最常用的纯化方法[19]。离子交换法纯化效果好，且氨基酸损失少，常用于中草药中游离氨基酸粗物的纯化。也可用活性炭纯化法，但活性炭对部分氨基酸也能吸附，造成氨基酸的损失[22]。也可采用C18Sep-Pak 柱法对氨基酸进行纯化，但价格昂贵。综上所述，较佳的氨基酸粗提液的纯化方法是阳离子交换树脂法。

2 氨基酸色谱法分析

2.1 气相色谱法

气相色谱法是用气体做流动相的色谱法。气相色谱法要求被分析物在 196～450 ℃温度范围能够气化，但氨基酸含氨基和羧基等极性基团，在温度高时易分解，温度低时又不易气化，故采用气相色谱法分析氨基酸前需要对其进行衍生化处理，使其转变为易气化的物质；另一方面，气相色谱法分析样品时的柱温较高，因此，氨基酸衍生物的制备有很大难度。目前，适用于氨基酸衍生的衍生方法有硅烷化法、酯化法和酰化法等，这些衍生法虽具有灵敏度高的优点，但衍生化反应条件苛刻，要求在无水条件下进行，而且操作过程复杂，故氨基酸分析大多不采用气相色谱法。近年来，科研工作者开始发展允许水存在条件下衍生[23]，有比较好的应用前景。周芳等[24]将莲子心氨基酸水解液通过双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷衍生后，采用石英毛细管柱进行GC-MS 检测，结果可同时测得15 种氨基酸。张红漫等[25]将中药沙苑子用酸水解后，经羟基脂化和氨基酞化的衍生化反应，利用GCMS法可同时测定15 种氨基酸，为进一步开展沙苑子的药效及药理研究奠定了基础。

2.2 高效阴离子色谱-积分脉冲安培法

高效阴离子色谱-积分脉冲安培法是一种无需柱前和柱后衍生化的氨基酸直接分析方法。该方法不需要衍生过程，可避免由于衍生而产生的误差，且灵敏度高，测定氨基酸的检测限可达到pmol 或fmol 浓度级；另外，试验过程中流动相不使用甲醇、乙腈等有机试剂，而是采用水、氢氧化钠和醋酸钠溶液，是一种绿色环保的分析测定方法。Clarke 等[26]研发了一种高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测氨基酸的方法，该脉冲安培检测方法具有稳定性好和灵敏性高等优点，但存在常规金电极易被污染需要经常清洗的问题。针对此问题，Cheng 等[27]研制成功了“可抛弃”金电极用于氨基酸的分析测定，此方法无须经常清洗电极，且可保证分析结果与普通金电极一致，是一种比较好的方法。

2.3 高效阳离子交换色谱法

高效阳离子交换色谱法是利用离子交换原理和结合液相色谱技术来测定溶液中能够电离出阳离子物质的一种分离分析方法。Spackman 等[28]利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子的特性，将其在阳离子交换柱中分离，随后用茚三酮进行衍生、检测。此方法重现性好、准确可靠，能测定大多数氨基酸及其同系物，但仪器灵敏度不高，且价格较贵。

2.4 液相色谱法

2.4.1 衍生法 所有氨基酸中，除色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有紫外吸收性质外，其余氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收，因此，进行紫外或荧光检测前大多需要衍生。目前，已经发展了多种柱前、在线或柱后衍生的方法[29]。其中，在线衍生法是在色谱柱内进行衍生反应，所需反应试剂用量相对较少，但柱内需要配备反应搅拌装置；柱后衍生法可使用多种检测器，但要求反应速率快、反应室体积小。所以，目前使用较多的是柱前衍生方法，现已发展的柱前衍生试剂主要包括邻苯二甲醛（OPA）[30]、异硫氰酸苯酯（PITC）[31]、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）[32]、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）[33]、二硝基氟苯（DNFB）[34]、1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺（FDNPAA）[35]、磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-Cl）[36]、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）[37]和 2,4-二硝基氯苯（CDNB）[38]等。各种柱前衍生方法均有一定优缺点（表1），如OPA 法不能检测胱氨酸及亚氨基酸，且衍生产物稳定性差，其最大优点是无过量衍生试剂及副产物干扰；FMOC 法可检测亚氨基酸，且衍生产物稳定，荧光和紫外均可检测，缺点是不能检测胱氨酸，副产物难以去除，对测定有干扰；Dansyl-Cl 法既可检测亚氨基酸，又能检测胱氨酸，衍生物稳定性好，优点是无副产物干扰，缺点是紫外检测灵敏度较低；PITC 法可检测亚氨基酸和胱氨酸，衍生产物稳定，20 ℃可保存30 d，可采用真空干燥法去除多余衍生试剂，效果良好，但即使极微量的衍生试剂也可污染色谱柱而影响柱效。2006年6月，在天津市召开的药品中氨基酸的测定方法研讨会推荐首选测定方法为 PITC 柱前衍生法。采用紫外检测时基线平稳，衍生物的稳定性较好，且衍生反应时间对衍生效率影响不大，灵敏度可达100 pmol。当采用荧光检测时，灵敏度可达pg（fmol）水平，几乎提高3 个数量级，但对流动相的纯度要求较高，梯度洗脱会引起基线漂移；对检测条件要求苛刻，氨基酸含量较低的样品适宜采用荧光检测法检测。另外，液相色谱法分离测定氨基酸时常用氨基酸分析专用方法包，诸如Waters 公司开发的AccQ-Tag 试剂包法和Pico-Tag 试剂包法，配合优化的溶剂洗脱条件及专用分析柱，使氨基酸在20 min内得到高效分离，灵敏度可达0.5～1.0 pmol 级，一、二级氨基酸都能测定，衍生操作简单，分析时间短。但是，因衍生试剂方法包价格较高而限制了其广泛应用。氨基酸的分离亦可采用普通的反相色谱法，如采用C18，C8柱或 BEH Amide 亲水色谱柱[39]。

表1 柱前衍生高效液相色谱法分析氨基酸的衍生试剂及方法比较Table 1 Comparison of derivative reagents and methods for analysis of amino acids by High Performance Liquid Chromatography used pre-column derivatization

高效液相色谱柱前衍生化法通常无需考虑衍生反应的动力学因素，但衍生存在衍生化试剂不稳定、试剂干扰、耗时以及个别氨基酸衍生化困难等问题。因此，研究工作者纷纷开发无需衍生的液相色谱氨基酸分析方法。

2.4.2 未衍生法 蒸发光散射检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）是一种新型通用高效液相色谱检测器。相比紫外或荧光检测器，其响应不受物质本身结构和光学性质的限制。由于ELSD 具有可以直接检测无紫外、荧光特性物质的优点，所以尤其适用于未衍生氨基酸的直接检测。王玉红等[3]建立了一种采用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器（RHPLC-ELSD）直接测定20 种未衍生基本氨基酸的分析方法，并将其用于氨基酸注射液中氨基酸含量的测定，所得检测结果具有良好的重现性。

质谱检测器：LC-MS联用技术能够提取特征性离子，一般不需要对样品进行完全的分离和衍生化前处理，对于样品的分离度要求相对较低，方便、快速。随着同位素稀释质谱法的应用发展，氨基酸分析结果的准确度和精确度得到了进一步的提高[40]。LC-MS 法应用广泛，如研究者采用LC-ESI-MS测定了藏药中20种游离氨基酸含量[41]，此法灵敏度高、重现性较好，可检测中药材中痕量氨基酸，弥补HPLC 的缺陷。

随着小颗粒填料和仪器耐压等相关技术的进一步完善，超高压液相色谱技术也日益广泛应用。世界第一个商品化超高效液相色谱系统于1996年问世后，便增加了色谱分析的通量及色谱峰容量。王星等[42]以中药材天南星为研究对象，开发了中药材中氨基类成分的超高效液相色谱-串联质谱的分析方法，结果表明，此法可快速地对中药中的氨基类成分进行定性分析。任浩等[43]建立了UPLC-TQ-MS（不需要柱前衍生）；同时测定银杏花粉中24 种游离氨基酸含量的方法，所测的24 种氨基酸呈现出良好的线性关系和较好的加样回收率。

3 结语与展望

中草药成分十分复杂，目前对中草药中氨基酸的分离分析方法研究已经取得了一定进展，但每种方法各有利弊，分析方法优劣评价需综合考虑多种因素的影响。粗氨基酸样品制备中微波水解法耗时短、能耗低，随后80%乙醇纯化法毒性小、污染低，是比较好的前处理方法；柱前衍生反相高效液相色谱分析法是目前应用较多的一种氨基酸分析方法，此方法未来的发展将主要集中在选择高稳定、高灵敏的衍生试剂，使方法更趋灵敏、可靠。然而，衍生分析法需要衍生化操作，对衍生产物的稳定性也需要考察，不利于直接、快速地测定氨基酸。无需衍生操作、适合大批次样品检测的高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法和高效液相色谱-蒸发光散射检测法无需引入衍生步骤和干扰，在未来的一段时间内将会有良好的应用前景。